麝香酮减轻高糖诱导的肾小管上皮细胞炎症损伤的机制研究

张惠娜，谷 巍，王 菲

糖尿病肾病是常见的一种糖尿病并发症，随着疾病进展糖尿病肾病逐步发展为慢性肾衰竭，最终导致患者死亡。体内持续高糖可促使肾小管上皮细胞炎症反应的发生，并可进一步诱导肾小管上皮细胞凋亡，进而加重肾小管上皮细胞损伤，而肾小管上皮细胞损伤是引起糖尿病肾病的重要病理基础[1]。中药具有毒副作用小且效果好等优点，在抗炎、抗细胞凋亡等方面具有重要作用，研究表明部分中药可通过减轻高糖诱导的肾小管上皮细胞损伤，减缓糖尿病肾病的发展进程[2-4]。麝香酮属于一种中药活性单体，可缓解心肌缺血症状，研究表明其可通过抑制多柔比星诱导的心肌细胞凋亡，减轻心肌细胞损伤[5]。miR-191在肾脏缺血再灌注损伤细胞中表达升高，并可通过促进肾小管上皮细胞凋亡，促进肾脏缺血再灌注损伤[6]。但麝香酮和miR-191对高糖诱导的肾小管上皮细胞炎症损伤的影响尚未可知。因此，本研究旨在探讨麝香酮是否通过调控miR-191的表达进而影响高糖诱导的肾小管上皮细胞炎症损伤。

1 材料与方法

1.1材料与试剂 麝香酮购自上海同田生物技术有限公司(批号：541-91-3，纯度≥98%)；人肾小管上皮细胞HK-2购自上海奥陆生物科技有限公司；凋亡检测试剂购自碧云天生物技术研究所；Lipofectamine2000购自美国Invitrogen公司；miRNA提取试剂、逆转录与qRT-PCR试剂购自美国Thermo Fisher公司；anti-miR-191、anti-miR-NC、miR-191 mimics、miR-NC购自上海吉玛制药技术有限公司；白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所；兔抗人Cleaved-caspase3、Cleaved-caspase9抗体购自美国CST公司。

1.2研究方法

1.2.1高糖诱导的肾小管上皮细胞培养[7]：HK-2细胞置于DMEM完全培养基中，于37℃培养箱内培养，取对数生长期细胞(3×104个/ml)接种于6孔板(100 μl/孔)，用含30 mmol/L葡萄糖溶液的培养基培养24 h，记为高糖组(HG组)；用含5.5 mmol/L葡萄糖溶液的培养基培养24 h，记为正常对照组(Con组)。

1.2.2实验处理及分组：HK-2细胞(1×104个/ml)接种于96孔板(100 μl/孔)，用含不同浓度(5、10、20 μmol/L)麝香酮[8]与30 mmol/L葡萄糖溶液的培养基培养24 h，分别记为HG+低剂量组、HG+中剂量组、HG+高剂量组。采用脂质体转染法将anti-miR-NC、anti-miR-191分别转染至HK-2细胞，加入含30 mmol/L葡萄糖溶液的培养基中培养24 h，分别记为HG+anti-miR-NC组、HG+anti-miR-191组。采用脂质体转染法将miR-NC、miR-191 mimics分别转染至HK-2细胞，加入含20 μmol/L麝香酮与30 mmol/L葡萄糖溶液的培养基中培养24 h，分别记为HG+麝香酮+miR-NC组、HG+麝香酮+miR-191组。

1.2.3ELISA法检测IL-6、TNF-α水平：收集各组HK-2细胞培养液上清，采用ELISA法检测培养液中IL-6、TNF-α水平，按照试剂盒说明书操作，在反应孔内加入标准品或待测样品100 μl，在空白对照孔内加入稀释液100 μl，待空白对照孔细胞调零后应用酶标仪检测450 nm波长处吸光度(A)值，根据标准品计算IL-6、TNF-α水平。

1.2.4流式细胞术检测细胞凋亡率：取各组HK-2细胞经1000 r/min离心6 min后弃上清，加入预冷PBS液洗涤细胞后再加入结合缓冲液重悬细胞500 μl，按照凋亡检测试剂盒说明书操作并应用FACS Calibur流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.2.5qRT-PCR检测细胞中miR-191表达：用miRNA提取试剂盒分别提取各组HK-2细胞总RNA，应用逆转录试剂盒将总RNA逆转录合成cDNA，以cDNA 2 μl进行PCR扩增反应，采用2-ΔΔCt法计算miR-191相对表达量。

1.2.6Western blot法检测Cleaved-caspase3、Cleaved-caspase9蛋白表达：收集各组HK-2细胞加入蛋白裂解液提取细胞总蛋白，采用BCA法检测蛋白浓度，按照每孔30 μg蛋白样品上样进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳，电泳条件：80 V 30 min，120 V 90 min，根据marker位置切胶并应用湿转膜仪将蛋白凝胶转移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜，用5%脱脂奶粉封闭PVDF膜2 h，分别加入Cleaved-caspase3(1︰1000)、Cleaved-caspase9(1︰1000)一抗与内参GAPDH抗体(1︰3000)稀释液4℃孵育过夜，加入二抗稀释液(1︰5000)室温孵育1 h，电化学发光试剂显影，应用Image J软件分析各条带灰度值。

2 结果

2.1麝香酮对高糖诱导的肾小管上皮细胞炎性因子表达的影响 与Con组比较，HG组IL-6、TNF-α水平升高(P<0.05)；与HG组比较，HG+低剂量组、HG+中剂量组、HG+高剂量组IL-6、TNF-α水平降低(P<0.05)，且随着麝香酮处理剂量的增加IL-6、TNF-α水平逐渐降低(P<0.05)。见表1。

表1 麝香酮对高糖诱导的肾小管上皮细胞炎性因子表达的影响

2.2麝香酮对高糖诱导的肾小管上皮细胞凋亡的影响 与Con组比较，HG组Cleaved-caspase3、Cleaved-caspase9蛋白水平升高(P<0.05)；与HG组比较，HG+低剂量组、HG+中剂量组及HG+高剂量组Cleaved-caspase3、Cleaved-caspase9蛋白水平降低(P<0.05)，且随麝香酮处理剂量的增加Cleaved-caspase3、Cleaved-caspase9蛋白水平逐渐降低(P<0.05)。见图1和表2。Con组、HG组、HG+低剂量组、HG+中剂量组及HG+高剂量组细胞凋亡率分别为(5.77±0.56)%、(31.65±3.11)%、(23.86±2.09)%、(17.05±1.31)%、(9.43±0.81)%。与Con组比较，HG组细胞凋亡率升高(P<0.05)；与HG组比较，HG+低剂量组、HG+中剂量组及HG+高剂量组细胞凋亡率降低(P<0.05)，且随麝香酮处理浓度的增加细胞凋亡率逐渐降低(P<0.05)。见图2。

图1 麝香酮对高糖诱导的肾小管上皮细胞凋亡相关蛋白表达的影响Con组予5.5 mmol/L葡萄糖溶液培养24 h，HG组予30 mmol/L葡萄糖溶液培养24 h，HG+低剂量组、HG+中剂量组、HG+高剂量组分别予30 mmol/L葡萄糖溶液+5、10、20 μmol/L麝香酮培养24 h

图2 麝香酮对高糖诱导的肾小管上皮细胞凋亡流式图Con组予5.5 mmol/L葡萄糖溶液培养24 h，HG组予30 mmol/L葡萄糖溶液培养24 h，HG+低剂量组、HG+中剂量组、HG+高剂量组分别予30 mmol/L葡萄糖溶液+5、10、20 μmol/L麝香酮培养24 h

表2 各组肾小管上皮细胞凋亡相关蛋白表达比较

2.3麝香酮对高糖诱导的肾小管上皮细胞miR-191表达的影响 Con组、HG组、HG+低剂量组、HG+中剂量组及HG+高剂量组miR-191表达量分别为1.00±0.00、3.58±0.22、2.81±0.21、1.97±0.17、1.36±0.12。与Con组比较，HG组miR-191表达量升高(P<0.05)；与HG组比较，HG+低剂量组、HG+中剂量组、HG+高剂量组miR-191表达量降低(P<0.05)，且随麝香酮处理浓度的增加miR-191表达量逐渐降低(P<0.05)。

2.4干扰miR-191表达对高糖诱导的肾小管上皮细胞炎症损伤的影响 与HG+anti-miR-NC组比较，HG+anti-miR-191组IL-6水平、TNF-α水平、细胞凋亡率和Cleaved-caspase3、Cleaved-caspase9蛋白水平均降低(P<0.05)，见图3、表3。

表3 干扰miR-191表达对高糖诱导的肾小管上皮细胞炎症损伤的影响

图3 干扰miR-191表达对高糖诱导的肾小管上皮细胞凋亡的影响A.凋亡相关蛋白表达；B.细胞凋亡流式图

2.5过表达miR-191逆转麝香酮对高糖诱导的肾小管上皮细胞炎症损伤的作用 与HG+麝香酮+miR-NC组比较，HG+麝香酮+miR-191组IL-6水平、TNF-α水平、细胞凋亡率和Cleaved-caspase3、Cleaved-caspase9蛋白水平均升高(P<0.05)。见图4、表4。

表4 过表达miR-191逆转麝香酮对高糖诱导的肾小管上皮细胞炎症损伤的作用

图4 过表达miR-191逆转麝香酮对高糖诱导的肾小管上皮细胞凋亡的作用A.凋亡相关蛋白表达；B.细胞凋亡流式图

3 讨论

高血糖可引起线粒体功能障碍从而促进糖尿病肾病的发生，由于活性氧、促炎因子的大量生成导致肾小管上皮细胞损伤，因而减轻肾小管上皮细胞损伤成为治疗糖尿病肾病的关键。高糖环境下可促使活性氧等过多生成造成核酸断裂、酶失活等破坏性过程，进而导致细胞凋亡，文献报道部分中药可通过抑制高糖诱导的肾小管上皮细胞凋亡，减轻细胞损伤[9]。miRNA在高糖诱导的肾小管上皮细胞中异常表达，并可通过调控靶基因表达而参与肾小管上皮细胞损伤过程[10]。已有研究发现,部分中药可通过调控miRNA的表达减缓糖尿病肾病的发展进程[11]。

中药麝香具有镇心安神等功效，麝香酮是麝香的主要活性成分，研究表明麝香酮具有抑制神经细胞凋亡的作用，可减轻模型大鼠早期创伤性脑损伤并改善其神经功能[12-13]。麝香酮还可减轻脂多糖诱导的小胶质细胞损伤[14]。本研究结果显示，高糖诱导的肾小管上皮细胞培养液中IL-6、TNF-α水平升高，与文献[15]报道结果相似，提示成功构建了高糖诱导的肾小管上皮细胞炎症损伤模型；且麝香酮还以浓度依赖性的方式降低高糖诱导的肾小管上皮细胞培养液中IL-6、TNF-α水平。本研究结果还显示，高糖诱导的肾小管上皮细胞凋亡率和Cleaved-caspase3、Cleaved-caspase9蛋白水平升高，与既往研究[16]结果相似;且随麝香酮处理浓度的增加，高糖诱导的肾小管上皮细胞凋亡率和Cleaved-caspase3、Cleaved-caspase9蛋白水平逐渐降低，提示麝香酮可能通过抑制高糖状态诱导的肾小管上皮细胞炎症反应，从而达到抑制细胞凋亡、减轻细胞炎症损伤的目的。

本研究结果还显示，高糖诱导的肾小管上皮细胞中miR-191表达量升高，且麝香酮以浓度依赖性的方式降低miR-191表达量，提示麝香酮可能通过抑制miR-191表达而发挥作用。研究表明，miR-191在急性缺血性脑卒中患者中表达升高，miR-191过表达可促进OGD/R诱导的内皮细胞损伤[17]。miR-191在异氟烷诱导的神经损伤小鼠模型海马组织中表达上调，表达下调可减轻其神经损伤程度[18]。miR-191在肝缺血再灌注损伤和缺氧复氧诱导的肝细胞损伤小鼠模型肝组织中表达上调，干扰其表达可抑制模型小鼠肝损伤进程[19]。本研究结果显示，上调miR-191表达可以拮抗麝香酮对高糖诱导肾小管上皮细胞的炎症损伤及凋亡作用，提示麝香酮可能通过调控miR-191表达，从而减缓糖尿病肾病的进程。

综上，麝香酮通过抑制miR-191表达抑制高糖诱导肾小管上皮细胞的炎症损伤及细胞凋亡，达到减轻细胞炎症损伤的目的，可为麝香酮治疗糖尿病肾病提供理论基础，还可为糖尿病肾病治疗药物的研发提供新的方向。