CARD9 PKM2 CMTM6在乳腺癌组织中的表达及相关性研究

李 玲,何 霞,周自城,高晓玉

(四川省雅安市人民医院检验科，四川 雅安 625000)

乳腺癌是最常见且严重威胁广大女性身心健康的恶性肿瘤，其中浸润、复发和转移是危及患者生命安全的主要因素[1]。目前临床上对于乳腺癌的发病机制尚未得到统一言论，认为其可能与饮食、环境、月经情况、婚育情况、乳腺疾病病史等因素相关[2]。目前临床暂无治疗乳腺癌特效药，随着分子生物学的发展，发现乳腺癌在分子水平上具有高度异质性，故从分子角度阐明乳腺癌的转移、复发的机制，寻找乳腺癌新的分子靶标[3]。故在本文研究中，选取2019年11月至2020年11月期间于我院就诊的79例乳腺癌患者作为研究对象，检测乳腺癌及癌旁组织中胱天蛋白酶募集域蛋白9(Caspase recruitment domain protein 9，CARD9)、M2型丙酮酸激酶(M2 pyruvate kinase，PKM2)、趋化因子样因子超家族成员6(Chemokine like factor superfamily member 6，CMTM6)表达水平，分析其与患者临床病理特征的相关性，旨在为乳腺癌的诊断、治疗及预后判断提供参考依据。

1 资料与方法

1.1一般资料:选取2019年11月至2020年11月我院接诊的79例乳腺癌患者研究对象，年龄35～74岁，平均年龄(51.78±21.11)岁，BMI 24～36kg/m2，平均BMI(28.50±7.13)kg/m2。所有研究对象及家属均知情同意本次研究，且经我院伦理委员会批准。纳入标准：①符合《中国抗癌协会乳腺癌诊治指南与规范(2019年版)》[4]中乳腺癌的诊断标准；②经病理检查确诊为乳腺癌且在我院就诊并行手术且术后病检确诊为乳腺癌者；③均为首发病例。排除标准：①年老体弱、存在严重合并症不适合手术者；②处于妊娠期或哺乳期的女性；③出现远处转移者；④近1个月内进行过重大手术者。

1.2方 法

1.2.1标本采集:取乳腺癌患者手术切除癌组织及癌旁组织标本作研究，其中癌组织79例，另外距癌组织>5cm且经病理学证实的38例癌旁正常乳腺癌组织作为癌旁组织，将制作的组织标本采用40g/L多聚甲醛进行固定，并进行常规石蜡包埋，厚度为3μm，连续切片作免疫组化标记。

1.2.2免疫组化法检测方法:采用免疫组化法检测CARD9、PKM2、CMTM6表达，将癌组织、癌旁组织切片放置在二甲苯中浸泡2次(15min/次)，捞出后将多余水份取出后分别放置在无水乙醇溶液、95%乙醇溶液以及85%乙醇溶液中浸泡3min，采用自来水、PBS缓冲液冲洗3次(时间分别为1min/次、3min/次)；将EDTA抗原修复液加热至沸腾后使其处于保温状态并将切片放入已沸腾的修复液中并继续加热20min，待EDTA溶液冷却至室温，将切片取出采用蒸馏水、PBS缓冲液均冲洗3次(3min/次)；去除PBS缓冲液，分别加入100μL的鼠抗人CARD9、PKM2、CMTM6抗体，室温下孵育60min后，采用PBS缓冲液冲洗3次(3min/次)；去除PBS缓冲液，加入100μL酶标羊抗兔IgG聚合物，室温下孵育15min后采用PBS缓冲液冲洗3次(3min/次)；去除PBS缓冲液，加入100～200μL DAB显色液孵育3～5min，显微镜下观察染色结果；自来水冲洗切片后采用苏木素染色液复染10～30s，采用PBS缓冲液冲洗反蓝；脱水、透明、封片：并将切片分别放置在无水乙醇溶液、95%乙醇溶液以及85%乙醇溶液中浸泡3min，二甲苯透明，然后采用中性树胶和盖玻片封片，显微镜镜查。免疫组化染色结果:于高倍镜(×200)下随机选取5个视野，计算阳性细胞百分率，①染色强度：无着色、浅黄色、棕黄色、棕褐色分别记为0分、1分、2分、3分；②阳性细胞百分数：阳性细胞<10%、阳性细胞1%～50%、51%～75%、>75%分别记为0分、1分、2分、3分，上述两者乘积作为最后结果，阴性、阳性分别为0～1分、2～9分。

1.2.3RT-PCR检测方法:采用RT-PCR法检测CARD9、PKM2、CMTM6表达，实验步骤：将1mL TRNzol加入癌组织、癌旁组织取总DNA并检测其纯度和浓度，提取2μg总DNA并加入内参GAPDH及目的小分子RNA CARD9、PKM2、CMTM6逆转录引物，42℃ 15min，85℃ 5s，逆转录合成cDNA；PCR反应条件：95℃ 预变性10min，95℃、60℃、95℃、60℃、95℃时间分别12s、40s、15s、30s、15s(收集荧光)，40个循环，使用Primer5.0软件对引物序列进行设计，每个样本设3个复孔，同时以ddH2O设为阴性对照，CARD9引物序列上游：5'-CCGCGTCTTCTCCATGAT-3'，下游：5'-CCGCAGCTCCTTGATGAA-3'；PKM2引物序列上游：5'-GGTGTTTGCGTCATTCATCC-3'，下游：5'-ACCGTCCAATCATCATCTTCTG-3'；CMTM6引物序列上游：5'-AGGCAATAGGTCAGTAAGGTCAGTAGG-3'，下游：5'-GTCCAGAAGCAGTCAGTCTCAAGTC-3'；内参GAPDH引物序列上游：5'-AACAGCCTCAAGATCATCAGCAA-3'，下游：5'-GACTGTGGTCATGAGTCCTTCCA-3'。

1.2.4计算公式:灵敏度=真阳性/(真阳性+假阴性)×100%，特异度=真阴性/(真阴性+假阳性)×100%，诊断效率=真阳性+真阴性/(真阳性+假阳性+真阴性+假阴性)。

2 结 果

2.1CARD9、PKM2、CMTM6在癌组织和癌旁组织中的表达比较:CARD9、PKM2、CMTM6在癌组织中表达均高于癌旁组织，具有统计学差异(t=61.610、52.920、54.510，均P<0.05)，见表1、图1、图2、图3。

表1 CARD9 PKM2 CMTM6在癌组织和癌旁组织中的表达比较

图1 CARD9在癌组织、癌旁组织中免疫组织化学染色图(×200)a：癌组织；b：癌旁组织

图2 PKM2在癌组织、癌旁组织中免疫组织化学染色图(×200)a：癌组织；b：癌旁组织

图3 CMTM6在癌组织、癌旁组织中免疫组织化学染色图(×200)a：癌组织；b：癌旁组织

2.2CARD9、PKM2、CMTM6与乳腺癌患者临床病理特征的相关性分析:CARD9、PKM2、CMTM6与乳腺癌患者年龄、肿瘤部位、病理类型、绝经情况、肿瘤大小无关，无统计学差异(P>0.05)。低分化程度、有淋巴结转移、Ⅲ～Ⅳ期乳腺癌患者CARD9、PKM2、CMTM6表达高于高中分化程度、无淋巴结转移、Ⅰ～Ⅱ期，具有统计学差异(P<0.05)，见表2。

表2 CARD9 PKM2 CMTM6与乳腺癌患者临床病理特征的相关性分析

2.3CARD9、PKM2、CMTM6之间相关性分析：Pearson相关性分析显示，CARD9、PKM2之间正相关(r=0.257，P=0.022)；CARD9、CMTM6之间正相关(r=0.260，P=0.021)；PKM2、CMTM6之间正相关(r=0.254，P=0.024)，见图4。

图4 CARD9、PKM2、CMTM6之间相关性图

2.4CARD9、PKM2、CMTM6对乳腺癌的预测价值:分别绘制CARD9、PKM2、CMTM6单项和三者联合对乳腺癌诊断的ROC曲线，结果显示，CARD9、PKM2、CMTM6单项检测诊断乳腺癌的ROC曲线下面积分别为716(95%CI：0.591～0.840)、0.653(95%CI：0.531～0.774)、0.735(95%CI：0.611～0.860)，而CARD9、PKM2、CMTM6联合检测诊断乳腺癌的ROC曲线下面积为0.833(95%CI：0.741～0.925)，见表3、图5。

图5 CARD9、PKM2、CMTM6诊断乳腺癌的ROC曲线图

表3 CARD9 PKM2 CMTM6诊断乳腺癌的效能分析

3 讨 论

乳腺癌患者早期时不具备典型的症状和体征，常在体检或乳腺癌筛查中被发现，此病的典型体征包括乳腺肿块、乳头溢液、皮肤改变、腋窝淋巴结中以及乳头或乳晕异常等[5]。目前临床多采用手术、放疗、化疗、内分泌治疗乳腺癌等，尽管治疗手段不断进步，仍有部分乳腺癌患者出现远处转移现象，进而导致治疗失败，故从分子角度阐明乳腺癌的转移、复发机制，寻找乳腺癌新的分子靶标，对于完善乳腺癌患者的治疗和提高预后意义重大[6]。

临床研究证实，癌症的发生与细胞增殖、凋亡等生物学行为相关，其中细胞中病理、生理因子可通过不同的初级信号介导凋亡，而凋亡的最终通路均为胱天蛋白酶的激活[7]。CARD9是CARD蛋白酶家族主要成员之一，具有胱天蛋白酶激活的作用，在多种原发性肿瘤组织中呈异常高表达，通过形成CARD-CARD结构，实现细胞内信号传导并参与细胞生物学行为[8]。有研究显示[9]，CARD9是一个调节核转录因子-KB等信号通路的重要的因子，CARD9高表达可促进乳腺癌细胞的增殖，提示其可能参与乳腺癌的发生发展过程，研究结果证实CARD9与乳腺癌患者年龄、肿瘤大小无关，但与患者淋巴结转移、临床分期相关。在本文研究中，CARD9在癌组织中表达显著高于癌旁组织，说明其在乳腺癌中呈高表达；高中分化程度CARD9高于低分化程度，有淋巴结转移CARD9高于无淋巴结转移，Ⅲ～Ⅳ期CARD9高于Ⅰ～Ⅱ期，说明随着分化程度加重、淋巴结转移、临床分期加重，CARD9越高。

PKM2是一种限速酶，在糖酵解途径中显得尤为重要，其在肿瘤细胞中呈高表达，在肿瘤的代谢过程中发挥着举足轻重的作用。在贺帅[10]等研究中，糖代谢异常在乳腺癌进展中起重要作用，糖酵解可产生大量乳酸，为糖异生提供原料，此外导致外周组织对葡萄糖的利用障碍，有氧糖酵解和糖代谢异常相互作用促进肿瘤的发生、发展，PKM2在有氧糖酵解的建立以及肿瘤发生、发展及转移中起重要作用。姚奥[11]等研究，PKM2在细胞质中与其他糖酵解酶共同构成糖酵解酶复合体，为癌细胞的生长代谢提供能量并保证其长时间繁殖。本研究PKM2在乳腺癌患者中呈高表达，参与肿瘤细胞的有氧糖酵解的催化作用，促进细胞糖酵解、增殖，且为癌细胞提供生长所需能量。本文研究结果表明，PKM2在乳腺癌组织中高表达，高中分化程度PKM2高于低分化程度，有淋巴结转移PKM2高于无淋巴结转移，Ⅲ～Ⅳ期PKM2高于Ⅰ～Ⅱ期，说明随着分化程度加重、淋巴结转移、临床分期加重，PKM2越高。

CMTM6是CMTM家族主要成员之一，可激活和趋化大量免疫细胞并对肿瘤细胞的增殖和侵袭产生影响。临床实践表明，CMTM6在肺腺癌患者中表达上调，且与患者临床分期、远处转移相关，且与PD-L1水平密切相关[12]。冯晓波[13]等研究，CMTM6在口腔鳞癌中呈高表达，且与PD-1、PD-L1表达呈正相关，表明其与PD-1、PD-L1在调控肿瘤微环境的免疫反应中具有协同作用，其机制可能为激活或加强PD-1/PD-L1信号通路，发挥免疫抑制的作用。杨小骏[14]等研究，CMTM6在乳腺癌中表达显著高于癌旁组织，且与乳腺癌病理分型、HER2阳性显著、患者预后相关，CMTM6高表达是乳腺癌预后评估的独立危险因素。在本文研究中，CMTM6癌组织中表达高于癌旁组织，说明其在乳腺癌中呈高表达，高中分化程度CMTM6高于低分化程度，有淋巴结转移CMTM6高于无淋巴结转移，Ⅲ～Ⅳ期CMTM6高于Ⅰ～Ⅱ期，说明随着分化程度加重、淋巴结转移、临床分期加重，CMTM6越高。

综上所述，CARD9、PKM2、CMTM6与乳腺癌患者分化程度、淋巴结转移、临床分期有关，CARD9、PKM2、CMTM6两两之间呈线性相关，且均参与乳腺癌的发生和演变过程，有望成为乳腺癌无创诊断的一种新手段，为乳腺癌的早期诊治提供一定的理论参考。但本文研究存在样本量较少、病例来源受地域限制、指标不够全面不足，故在后续研究中需开展多中心、多样本的研究，为临床提供可靠依据。