三七总皂苷联合氨基胍治疗对糖尿病肾病大鼠肾功能血CRP TNF-α MDA和SOD水平的影响

郑杰洪，郑映苗，陈凤梧

(汕头大学医学院第一附属医院，广东 汕头 515041)

炎症反应贯穿于糖尿病肾病的产生、发展的整个过程，在这个过程血浆中C-反应蛋白(C-reactive protein，CRP)、肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor-α，TNF-α)等炎性因子含量明显增高，可能是糖尿病肾病较强的预示因素[1]。并且，近年来许多研究证实，氧化应激反应在糖尿病肾病的发生、发展中同样发挥着重要作用[2]。因此笔者推测，通过抗炎症和抗氧化应激反应，能够抑制转化生长因子-β1(Transforming growth factor-β1，TGF-β1)的表达，抑制肾脏纤维化，延缓糖尿病肾病进展。三七为传统中药，其使用已经有近2000年的历史，三七总皂苷(Panax Notoginseng Saponins，PNS)从其中提取多种皂苷类成分综合体，具有降低血液黏度、降低血脂、改善微循环及强大的抗氧自由基作用[3]。但单一药物作用效果有限，临床倾向采用药物联合进行治疗。氨基胍(Aminoguanidine，AG)是缓解糖尿病肾病进展的一种非酶糖基化抑制剂，可通过阻碍糖基化终末产物(Glycosylation end products， AGEs)的形成来延缓病情进展[4]。目前，关于PNS、AG对糖尿病肾病大鼠的炎症反应、氧化应激反应及病理改善方面的研究十分匮乏。因此，本研究主要观察PNS联合AG对糖尿病肾病大鼠肾脏病理性造成的改变，探究其对糖尿病肾病大鼠血浆中CRP，TNF-α浓度影响和氧化应激反应的影响，为糖尿病肾病的治疗提供依据，研究结果如下。

1 材料与方法

1.1动物:清洁级6周龄SD雄性大鼠75只(广州南方医大实验动物科技发展有限公司)，重(180±25)g。饲养环境：温度(23±2)℃，相对湿度50%～60%，通风、安静。

1.2分组造模:将试验大鼠按清洁级分笼喂养，适应性喂养1周后，将大鼠按随机数字表法分为正常对照组15只及实验组60只。试验组对大鼠腹腔内注射链脲佐菌素溶液进行造模，对大鼠腹腔内注射等量枸橼酸盐缓冲液。4周后采用血糖分析仪(美国强生)检测大鼠血糖、尿糖、24h尿量和24h尿蛋白，血糖≥16.7mmoL/L，尿糖持续3d以上3+则表示糖尿病大鼠造模成功，24h尿量大于造模前50%及24h尿蛋白排泄(UAE)>30mg为糖尿病肾病造模成功。本试验中有52只造模成功，成功率为88.33%，将造模成功的大鼠按照随机数字表法简单随机分为4组，各13只。平衡喂养3d后，开始给药，给药时间和剂量参考文献[4]。PNS组采用100mg/kg/d的PNS进行灌胃治疗；AG组采用100mg/kg/d的AG进行灌胃治疗，联合组采用100mg·kg-1·d-1的PNS和100mg·kg-1·d-1的AG进行灌胃治疗；正常对照组和模型组采用相同量的生理盐水灌胃处理。所有大鼠分笼饲养，饮水进食均自由，不予以任何降血糖药物。各组均连续给药8周，期间无大鼠死亡。

1.3肾组织病理切片观察:第4周时，将大鼠处死，取双侧肾脏组织，将部分肾脏组织置于4%多聚甲醛中处理、固定，石蜡包埋、切片处理后，常规方法实施病理PAS染色。电子显微镜观察各组肾脏组织病理形态变化，并采用双盲法进行评估。将PAS染色组织切片放大400倍，每只大鼠随机选取10个肾小球，测量肾小球平均截面积(A)，并计算肾小球容量(V)。V=β/K×A3/2，β=1.38，K(形态系数)=1.1。

1.4指标检测:①血糖检测:采用血糖分析仪检测各组血糖水平。②血肌酐、24h尿蛋白检测:采集大鼠腹部主动脉血液，采用HF-3800全自动生化分析仪(康宇医疗器械有限公司)检测血肌酐水平；采用代谢笼采集大鼠处死前1d的24h尿液，采用马斯亮兰法检测24h尿蛋白含量。③血浆CRP、TNF-α水平检测:取腹部主动脉血液，加速离心后，分离出血浆，采用免疫散射比浊法检测血浆CRP，采用免疫放射法检测TNF-α水平。④血清MDA、SOD水平检测:取腹部主动脉血液，加速离心，获取血清，采用比色法测定丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)水平。试剂盒均购自上海生物工程有限公司。

2 结 果

2.1各组大鼠病理改变和血糖水平比较:正常对照组肾小球外观规则完整，系膜细胞稀少，基底膜薄；肾小管形状清晰，基底膜无改变，实验组肾小球明显增大，系膜细胞增加，基底膜增厚，肾小管无明显改变；相比模型组，PNS组、AG组、联合组肾小球病理状态明显改善。见图1。

图1 各组大鼠病理PAS染色图(×200)注：1a为正常对照组；1b为模型组；1c为PNS组；1d为AG组；1e为联合组

模型组肾小球容量和血糖水平高于正常对照组(t=11.803、44.863，P=0.000<0.05)，PNS组、AG组、联合组肾小球容量和血糖水平低于模型组，联合组肾小球容量和血糖水平高于PNS组、AG组：差异均有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 各组大鼠肾小球容量和血糖水平比较

2.2各组大鼠肾功能比较:模型组血肌酐、24h尿蛋白水平高于正常对照组(t=25.216、57.950，P=0.000<0.05)，PNS组、AG组、联合组血肌酐、24h尿蛋白水平低于模型组，联合组血肌酐、24h尿蛋白水平高于PNS组、AG组：差异均有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 各组大鼠血肌酐24h尿蛋白水平比较

2.3各组大鼠血浆CRP、TNF-α水平比较:模型组血浆CRP、TNF-α水平高于正常对照组(t=47.238、15.949，P=0.000<0.05)，PNS组、AG组、联合组CRP、TNF-α水平低于模型组，联合组CRP、TNF-α水平高于PNS组、AG组：差异均有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 各组大鼠血浆CRP TNF-α水平比较

2.4各组大鼠血清MDA、SOD水平比较:模型组MDA水平高于正常对照组(t=12.000、10.616，P=0.000<0.05)，SOD水平低于正常对照组；PNS组、AG组、联合组MDA水平低于模型组，SOD水平高于模型组；联合组SOD水平高于AG组：差异均有统计学意义(P<0.05)。见表4。

表4 各组大鼠血清MDA SOD水平比较

3 讨 论

糖尿病肾病属严重微血管并发症，其危害较大，可逐渐损害肾功能，进展致终末期肾病，直至不可逆转肾功能衰竭，死亡率极高，给社会和家庭带来沉重的负担[5,6]。糖尿病病程10年以上患者有一半左右会出现糖尿病肾病，已成为危害人类健康的危险疾病。因此探究预防与控制糖尿病肾病发展是现阶段临床和基础研究关注的重点，对糖尿病肾病患者具有重要意义。目前糖尿病肾病治疗主要包括控制血糖、血压，使用血管紧张素转化酶抑制剂(ACEI)/血管紧张素Ⅱ受体阻滞剂(ARB)，调节血脂及生活方式等[7]，但疗效不尽人意。近年来，中医已在各个疾病的治疗方面取得了明显效果，因此近年来逐渐考虑将中医应用于糖尿病肾病的治疗[8]。糖尿病肾病在中医上气虚血瘀，宜进行益气养阴,活血化瘀治疗。利用“滋阴补肾”中药治疗糖尿病肾病在临床应用较为广泛，但活血化瘀治疗糖尿病肾病应用较少。PNS及AG为我国传统药物，具活血化瘀功效，还普遍应用于抗炎症反应[9]。而糖尿病肾病的发生、发展本身与炎症反应关系密切，因此考虑可将PNS和AG应用于糖尿病肾病。

本研究对链脲佐菌素溶液灌胃制造的糖尿病肾病大鼠模型分别予以不同治疗方式，结果显示糖尿病肾病会导致肾小球增大，系膜细胞增加，基底膜增厚，而采用PNS、AG治疗会显著改善这种病理变化；并且研究还显示PNS、AG及PNS联合AG均可降低肾小球容量、血糖、血肌酐、24h尿蛋白水平，其中PNS联合AG降低效果最为显著，与侯凯健等[10]报道结果一致。这是因为：PNS可有效减少TGF-β1表达，TGF-β1是导致肾小管上皮细胞转分化和肾间质纤维化的重要物质，因此PNS可改善肾脏功能；而AG可特异性抑制晚期糖基化终产物，保护肾脏，抑制一氧化氮合成，从而抑制肾小球增大和系膜增生，改善肾脏功能；PNS和AG改善肾脏功能的机制不同，因此两者联合能从多方面多角度更好的改善肾脏功能。并且，研究还显示PNS和AG具有改善血糖的作用，可能是因为血糖主要是靠肾脏代谢，当肾脏功能得到改善时，血糖代谢速率增加，故机体内血糖水平降低。目前糖尿病患者发生肾病的发病原理尚不清晰，但炎症学说受到众多学者的认可，认为炎症在糖尿病肾病的进展中占有重要地位[11]。本研究结果显示，糖尿病肾病大鼠中血浆CRP、TNF-α水平升高，且PNS、AG及PNS联合AG均可降低CRP、TNF-α水平，其中PNS联合AG降低效果最显著，说明PNS联合AG可明显抑制大鼠炎症反应，可能是改善肾功能的机制之一。分析原因可能为：CRP、TNF-α可促进TGF-β1的表达，加速肾脏损伤，而PNS具有改善微循环、消炎的作用，AG可抑制血管内皮生长因子(VEGF)表达，阻断炎症因子产生途径。并且，现在研究认为，糖尿病肾病的发展不仅与炎症因子有关，而且与氧化应激反应关系密切[12]。本研究分析各组大鼠的氧化应激反应显示，糖尿病肾病大鼠的MDA水平高于正常对照组，SOD水平低于正常对照组，且采用PNS、AG灌胃治疗可显著降低MDA水平，升高SOD水平。SOD水平降低，MDA升高提示氧化应激水平升高，因此本研究提示糖尿病肾病大鼠氧化应激水平升高，PNS、AG可抑制氧化应激反应。可能原因为：PNS具有较强的抗氧自由基作用，AG具有较强还原性，可减少过氧化基团对活性细胞中线粒体和生物酶的侵蚀，从而抑制氧化应激反应。

综上所述，PNS联合AG治疗对糖尿病肾病可显著改善肾小球病理状态和肾小球功能，降低血浆炎症因子CRP、TNF-α水平，减轻氧化应激水平，说明PNS联合AG治疗糖尿病肾病的原理可能与降低炎症反应和氧化应激反应有关。