ACE2与Collectrin在自发性高血压大鼠肾脏中的表达

王 乐，王卫杰，杨晓娟，黄 云，卢大雷

(1.河南省开封市医学科学研究所，河南 开封 475000 2.河南省开封市医用细胞生物学重点实验室，河南 开封 475000)

高血压是目前心血管和肾脏疾病的主要危险因素，其发病机制非常复杂[1]。有研究发现，血管紧张素转换酶2(angiotensin converting enzyme 2，ACE2)是肾素-血管紧张素-醛固酮系统(renin- angiotensin-aldosterone system，RAAS)中的一个关键调控酶，其表达量及活性异常可能参与高血压的发病过程[2,3]。Collectrin是RAAS中的孤立成员，是ACE2的同源物，同样在高血压的发生中起着重要的作用[4]。本研究拟通过测定ACE2和Collectrin在自发性高血压大鼠(SHR)体内的表达情况，探讨ACE2和Collectrin与高血压的关系，以期对高血压的预防和治疗提供新的思路。

1 材料与方法

1.1动物:12周龄SPF级雄性自发性高血压大鼠(SHR)12只和雄性WKY大鼠(WKY)12只，购自北京维通利华实验动物科技有限公司。大鼠随机分为两组：WKY对照组(n=12)和SHR组(n=12)，然后分别从WKY对照组和SHR组随机抽取6只，处死后迅速取其肾脏组织放入液氮，随后转入-80℃保存，检测ACE2与Collectrin mRNA和蛋白表达水平。其余大鼠继续喂养12周后处死进行相同检测。

1.2方 法

1.2.1血压的测定:在大鼠清醒状态下，采用ZH恒温式无创尾压动脉血压测量仪(安徽正华生物仪器设备有限公司)，间接测量尾动脉收缩压(SBP)。每只鼠连续测3次，取平均值。

1.2.2实时定量RT-PCR检测大鼠肾脏组织ACE2与Collectrin mRNA表达水平:采用Trizol法提取肾脏组织总RNA。以总RNA为模板按照反转录试剂盒说明书逆转录合成cDNA第一链。以GAPDH作为内参照，根据NCBI核酸数据库中ACE2、Collectrin和GAPDH的基因序列设计上下游引物(见表1)。Real-time PCR扩增总体积为25μL，反应条件为95℃ 10min；95℃ 15s，60℃ 45s，72℃ 30s，共40个循环；72℃ 10 min。以2-△△Ct表示ACE2 mRNA或Collectrin mRNA的相对表达水平。

表1 实时定量RT-PCR扩增引物序列

1.2.3Western blot检测大鼠肾脏组织ACE2与Collectrin 蛋白表达水平:使用RIPA裂解液提取肾脏组织的总蛋白，采用二喹啉甲酸法(BCA)测定蛋白浓度。通过SDS-PAGE电泳分离蛋白，然后将凝胶中的蛋白转入PVDF膜中，5%脱脂奶粉室温封闭1h，加入一抗4℃孵育过夜，TBST洗涤3次，每次5min；随后加入相应的HRP标记的二抗，37℃孵育1h，TBST洗涤3次，每次5min；最后用ECL化学发光检测蛋白条带。以GAPDH作为内参，分析蛋白条带灰度值，计算蛋白相对表达。

2 结 果

2.1大鼠血压和体重:与12周龄和24周龄 WKY对照组相比，同周龄SHR组收缩压明显升高，差异有统计学意义(P<0.01)，与12周龄SHR组比较，24周龄SHR组收缩压明显升高，差异有统计学意义(P<0.01)。详见表2。

表2 WKY和 SHR大鼠收缩压(mmHg)比较

2.2大鼠肾脏组织ACE2 mRNA的表达:与12周龄和24周龄 WKY对照组相比，同周龄SHR组大鼠肾脏组织中ACE2 mRNA 表达明显降低，有显著性差异(P<0.01)；与12周龄 SHR组相比，24周龄 SHR组ACE2 mRNA 表达明显降低，有显著性差异(P<0.01)。详见表3和图1。

表3 肾脏组织中两组ACE2 mRNA表达水平比较

图1 肾脏组织ACE2 mRNA表达水平注：与WKY对照组同周龄相比，*P<0.01；与组内12周龄大鼠相比，#P<0.01

2.3大鼠肾脏组织Collectrin mRNA的表达:与12周龄WKY对照组相比，同周龄SHR组Collectrin mRNA 表达有所升高，但差异不显著(P>0.05)；与24周龄WKY对照组相比，同周龄SHR组Collectrin mRNA 表达显著升高，有显著性差异(P<0.01)；与12周龄 SHR组相比，24周龄SHR组Collectrin mRNA 表达明显升高，有显著性差异(P<0.01)。详见表4和图2。

表4 肾脏组织中两组Collectrin mRNA表达水平比较

图2 肾脏组织Collectrin mRNA表达水平注：与WKY对照组同周龄相比，*P<0.01；与SHR组12周龄大鼠相比，#P<0.01

2.4大鼠肾脏组织ACE2蛋白表达:与12周龄和24周龄 WKY对照组相比，同周龄SHR组大鼠肾脏组织中ACE2 蛋白表达明显降低，有显著性差异(P<0.01)；与12周龄 SHR组相比，24周龄 SHR组ACE2 蛋白表达明显降低，有显著性差异(P<0.01)。详见图3。

图3 CE2蛋白表达水平注：与WKY对照组同周龄相比，*P<0.01；与SHR组12周龄大鼠相比，#P<0.01

2.5大鼠肾脏组织Collectrin蛋白表达:与12周龄WKY对照组相比，同周龄SHR组Collectrin蛋白表达有所升高，但差异不显著(P>0.05)；与24周龄WKY对照组相比，同周龄SHR组Collectrin蛋白表达显著升高，有显著性差异(P<0.01)；与12周龄SHR组相比，24周龄SHR组Collectrin蛋白表达升高，有显著性差异(P<0.01)。详见图4。

图4 大鼠肾脏组织Collectrin的蛋白表达水平注：与WKY对照组同周龄相比，*P<0.01；与SHR组12周龄大鼠相比，#P<0.01

3 讨 论

高血压是我国比较常见、发病率较高的心血管疾病之一。有动物实验研究发现ACE2是血压调节的重要基因，其作为候选基因，为高血压等疾病的药物治疗和防治提供了新的靶点[5]。Collectrin(Tmem27)是一种跨膜糖蛋白，与ACE2的的同源性约为50%，有研究表明Collectrin可解耦联内皮型一氧化氮合酶，导致高血压和血管功能障碍，删除Collectrin基因可能导致高血压、盐敏感性增高和压力-排钠利尿受损[6]。可见ACE2和Collectrin在高血压的发生发展中起重要作用。

本研究结果发现，在肾脏组织中，同周龄SHR组与WKY对照组相比，ACE2 mRNA和蛋白表达水平明显下降(P<0.01)，且随着周龄的增加，ACE2 mRNA和蛋白表达水平有明显下降的趋势。与佟倩[7]等研究结果一致。研究人员发现Collectrin在高血压和盐敏感性小鼠品系的血压调节中发挥作用[8]。本研究结果发现，在肾脏组织中，SHR组与WKY对照组相比，Collectrin mRNA和蛋白表达均有所升高，但只有24周龄Collectrin mRNA和蛋白表达有显著性差异(P<0.01)；且随着周龄的增加，Collectrin mRNA 和蛋白表达有明显升高的趋势。此外，本研究还发现SHR大鼠肾脏中ACE2 mRNA和蛋白表达下降时，Collectrin mRNA 和蛋白表达却明显升高，提示ACE2的低表达和Collectrin的高表达可能参与血压的调节。

综上所述，肾脏组织中的ACE2和Collectrin mRNA和蛋白表达可能与血压升高有关，且这两种基因在高血压的发生和发展过程中均起着重要的作用，但具体的作用机制还不清楚，所以下一步将通过研究与人类高血压相关基因的相互作用，有可能为人类高血压的发病机制、预防和治疗研究提供参考。