急性ST段抬高型心肌梗死患者载脂蛋白E基因多态性与痰瘀证候相关性研究

吴庆和， 杨昌河

（广州中医药大学第二临床医学院，广东广州 510120）

《中国心血管病报告2018》[1]指出，我国心血管病患病人数高达2.9亿，其中冠状动脉粥样硬化型心脏病（冠心病）患者达1 100万，而随着经济社会的不断发展，存在冠心病危险因素的人群不断扩大，患病人数仍将持续上升。冠心病已然成为不可忽视的重大健康问题，这其中，急性ST段抬高型心肌梗死（STEMI）作为冠心病的危重类型，有着较高的致死率和致残率，如何筛选出可能的危险因素并加以早期干预是重要的研究课题。诸多研究表明，载脂蛋白E（ApoE）基因型多态性被认为是冠心病的独立危险因素[2]，然而，对于ApoE基因多态性是否与急性心肌梗死相关尚存在争议[3]，关于STEMI与ApoE基因多态性的关系亦未明确。基于此，本研究旨在探究STEMI患者ApoE基因多态性、血脂水平及其与痰瘀证候的相关性，现将研究结果报道如下。

1 对象与方法

1.1 研究对象采用回顾性病例对照研究方法，检索广东省中医院胸痛中心管理系统，筛选2018年1月至2020年10月在广东省中医院急诊就诊或经120救护系统转运至广东省中医院的痰瘀证STEMI患者作为观察组。所有患者均行急诊冠状动脉造影术，且造影结果提示至少存在1支心外膜冠状动脉或其主要分支狭窄50%以上（排除冠状动脉肌桥），并根据患者临床特点及病变严重程度行单纯冠脉造影术、冠状动脉球囊扩张和（或）支架植入术。按照纳入及排除标准，经两名研究者分别复核后，共收集STEMI患者82例，其中男性65例，女性17例，年龄（62.9±12.7）岁。同时，收集同期在广东省中医院就诊的经体质辨识认定为痰湿质、湿热质、瘀血质的健康体检者，经年龄及性别匹配后作为对照组，共112例，其中男性90例，女性22例，年龄（62.0±12.6）岁，此部分受试者均无明显胸闷痛、心酶和心电图特征性变化等冠心病临床表现。

1.2 诊断标准STEMI诊断标准：参照《急性ST段抬高型心肌梗死诊断与治疗指南（2019）》[4]中的相关诊断标准。中医辨证标准：参照《中医内科病证诊断疗效标准》[5]中的相关辨证标准。对照组体质辨识参照《中医体质分类与判定》[6]。

1.3 纳入标准

1.3.1 病例纳入标准①于2018年1月至2020年10月在广东省中医院急诊就诊或经120救护系统转运至广东省中医院就诊，明确诊断为STEMI；②中医证型属于痰瘀证；③病历资料完整；④年龄≤85岁；⑤与其他研究个体不存在血缘关系；⑥知情并愿意配合ApoE基因型检测的患者。

1.3.2 对照组纳入标准①于2018年1月至2020年10月在广东省中医院体检；②无明显胸闷痛、心酶和心电图特征性变化等冠心病临床表现；③中医体质类型为痰湿质、湿热质、瘀血质；④年龄≤85岁；⑤与其他研究个体不存在血缘关系；⑥知情并愿意配合ApoE基因型检测者。

1.4 排除标准所有研究对象（包括观察组和对照组），若出现以下任意一项者均予以排除：①不符合纳入标准者；②年龄＞85岁者；③与其他个体存在血缘关系者；④不愿意配合ApoE基因型检测者；⑤患有缺血性脑卒中[7]、严重的肝肾功能异常、家族性高脂血症、恶性肿瘤以及免疫系统疾病的患者。

1.5 仪器和试剂载脂蛋白E（ApoE）基因型检测试剂盒（基因芯片法）、PCR扩增仪（ABI2720）、基因芯片阅读仪（Sinochips-PGA）均由珠海赛乐奇生物技术有限公司提供。ApoE基因型检测由广东省中医院中心实验室分子诊断组完成，其他血液生化指标由广东省中医院检验科进行检测。

1.6 研究方法

1.6.1 临床资料采集及血生化检测患者病史由首诊医生及时采集并进行体格检查，包括性别、年龄、现病史、既往史、家族史、吸烟史、饮酒史、身高、体质量等，紧急手术患者为术后补充采集，空腹8 h后于次日清晨进行静脉血采集，检测甘油三酯（TG）、总胆固醇（TC）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、肝肾功能等。

1.6.2 ApoE基因型检测方法应用基因芯片法，即采用ApoE基因检测试剂盒（国械注准20173400132）进行ApoE基因型检测。检测原理：PCR扩增特定基因片段与芯片上特异性核酸探针杂交检测特定的基因位点序列，放大基因芯片杂交信号至肉眼判读的水平，判读112位和158位基因类型。具体操作步骤参照说明书[8]。

1.6.2.1 样品处理 经过反复震荡、离心后洗脱的DNA储存于-20℃备用。

1.6.2.2 目的片段的PCR扩增 ①取PCR反应液，在室温（25℃）下融化离心10 s；②取制备样品加入PCR管中；③将PCR扩增管离心；④PCR扩增：95℃变性10 min；94℃，30 s→56℃，30 s→72℃，30 s，进行40个循环；72℃延伸5 min后于4℃密封保存备用。

1.6.2.3 基因芯片检测 扩增产物经变性、杂交、显色、离心、干燥后，应用自动分析报告系统判读基因型。

1.6.2.4 试验有效性判定（ApoE基因型检测芯片阴阳性判定）使用基因芯片阅读仪检测，相应位点的信号灰度值与背景灰度值差≥4判定结果为阳性，反之，＜4判定为阴性。ApoE基因型判定结果如图1。

图1 ApoE基因型判定Figure 1 ApoE genotype determination

1.7 统计方法应用SPSS25.0统计软件进行数据的统计分析。计量资料采用Kolmogorov-Smironov检验进行正态性检验，符合正态分布者用均数±标准差（±s）表示，组间比较采用方差分析；不符合正态分布者用中位数和四分位间距[M（Q1，Q3）]表示，组间比较采用两独立样本Wilcoxon符号秩和检验。计数资料用率或构成比表示，组间比较采用卡方检验及单因素Logistics回归分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 2组ApoE基因多态性比较表1结果显示：本研究共检测到ApoE基因型5种，未发现E2/2基因型，其中观察组基因型频率分别为E2/3型15.8%，E2/4型1.2%，E3/3型73.1%，E3/4型8.5%，E4/4型1.2%，而对照组只发现E2/3型、E3/3型、E3/4型3种基因型，频率分别为17.8%、70.5%、11.6%。观察组与对照组中，均以基因型E3/3频率和表现型E3等位基因频率最高，均大于70%。因E2/4、E4/4基因型频数较低，未纳入统计检验。2组间各基因型和表现型比较，差异均无统计学意义（P＞0.05），提示STEMI与ApoE基因型及表现型并无显著性相关。

表1 观察组与对照组ApoE基因型多态性比较Table 1 Comparison of ApoE genotype polymorphism between observation group and control group [例（%）]

2.2 2组血脂水平比较表2结果显示：虽然基因型之间差异并无统计学意义，但血脂水平与基因多态性的数据并不一致。观察组TC、LDL-C水平明显高于对照组，HDL-C水平明显低于对照组，差异均有统计学意义（P＜0.01），提示脂质异常可能是导致STEMI的危险因素之一，这与既往研究[9]结论一致；而2组间TG水平比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。

表2 观察组与对照组血脂水平比较Table 2 Comparison of serum blood lipid levels between observation group and control group[M（Q1，Q3），mmol·L-1]

2.3 观察组不同证型患者基因多态性比较表3结果显示：观察组STEMI患者以瘀证为主，占63.4%（52/82）。其中，E3/4基因型或E4表现型患者以痰证表现为主，而E3/3基因型和E3表现型患者以瘀证表现为主，E3/4基因型患瘀证的概率是E3/3型的0.17倍[OR=0.17，95%CI=（0.03，0.96）]，E4表现型患瘀证的概率是E3型的0.15倍[OR=0.15，95%CI=（0.03，0.82）]，差异均有统计学意义（P＜0.05）。而E2/3基因型和E2表现型组间比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。

表3 观察组不同证型急性ST段抬高型心肌梗死（STEMI）患者基因多态性比较Table 3 Comparison of gene polymorphisms in patients with different syndromes of acute STEMIin observation group [例（%）]

3 讨论

冠心病是在多种因素作用下的冠状动脉粥样硬化形成，进而使冠状动脉狭窄或闭塞或功能性改变，从而导致心肌缺血、缺氧甚至坏死的一类疾病。其中的急性ST段抬高型心肌梗死（STEMI）是其严重类型，而绝大多数的STEMI与不稳定的冠状动脉斑块破裂有关。对于冠状动脉粥样硬化的形成有各种各样的假说，“脂质浸润学说”就是其中的一种。已经有大量研究表明，异常的脂质代谢对冠心病的形成、发展及预后危害极大。作为维持和调控血脂代谢平衡有重要作用的载脂蛋白E（ApoE）及其基因多态性自然成为了冠心病的研究热点之一。ApoE基因位于第19号染色体长臂1区3带2亚带（19q13.2）[3]上，共产生E2/2、E2/3、E2/4、E3/3、E3/4、E4/4等6种主要基因型。一般认为，ApoE3为野生型，占比最高，达60%以上[10]，这也与本研究的70%以上占比相符。有研究[11]表明，ApoE基因可影响14%～16%的血中胆固醇水平。随着研究的不断深入，ApoE基因多态性也被认为是冠心病的独立危险因素[12]之一；同时，ApoE4等位基因还被认为与冠脉病变严重程度[13]、支架内再狭窄（ISR）[14]、早发冠心病[15]、冠心病痰瘀证候[16]等相关。然而，在心肌梗死方面并未取得一致意见[17-18]。关于STEMI发病与ApoE基因多态性的关系鲜有人提及，其中医证型与ApoE基因多态性的研究则更少。

中医理论认为，胸痹的病机是“阳微阴弦”，真心痛作为胸痹重症，“本虚标实”亦是被学术界所公认的病机。在标实方面，既往研究[19-20]表明，真心痛之证型多以气滞、痰凝、血瘀为标；而易建新[21]、曾吉祥等[22]在证素方面的研究中发现，血瘀、痰浊为最常见的中医证素。而纵观当前对真心痛的治疗，大多以活血化瘀为主而少以痰证为主进行治疗。

基于此，本研究以符合痰瘀证辨证的STEMI患者作为观察组，并与健康体检者的对照组相比较，进一步探讨STEMI患者的ApoE基因多态性分布和血脂水平情况，以及痰证和瘀证不同中医证素与ApoE基因多态性分布的关系。研究结果表明，观察组与对照组中E3等位基因频率最高，分别为74.2%、70.5%，与既往研究相符。而2组间各基因型和各表现型比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。然而，值得注意的是，在ApoE基因多态性无显著性差异的情况下，2组的血脂水平依然呈现出了显著性差异，其中观察组的TC、LDL-C水平明显高于对照组，而HDL-C水平则明显低于对照组，差异均有统计学意义（P＜0.01）。表明脂质异常可能是痰瘀证STEMI患者发病的危险因素，而并非负责编码、调节脂质代谢的ApoE基因，这与部分研究[17]认为ApoE基因多态性是急性心肌梗死危险因素的研究结论并不一致。另外，在痰瘀证素研究方面，STEMI患者以瘀证表现为主，占63.4%（52/82），但在具有E4等位基因的患者中，以痰证居多，差异有统计学意义（P＜0.05），提示E4表现型，尤其E3/4基因型可能与STEMI患者痰证相关，而E3/3基因型及E3表现型可能与瘀证相关。

ApoE基因多态性研究是精准医疗的缩影之一，也是中医“治未病”思想的重要体现。本研究结果表明，STEMI痰瘀证患者发病可能与ApoE基因多态性并不相关，而与脂质代谢异常相关。由此可推断，当存在ApoE4等位基因时，良好的脂质控制对患者病情的恢复仍是有益的；而在中医“治未病”方面，化痰可能比化瘀更值得大家关注。但由于本研究纳入的病例较少，因此，确切的结论有待进一步深入研究加以证实。