饮用天然矿泉水中产气荚膜梭菌 检测遇到的问题及解决办法

王晓娟 王惠玉

产气荚膜梭菌是一种革兰氏阳性杆菌，产芽孢，多以芽胞形式分布于土壤等自然界中，也存在于人、动物及其肠道中，是肠道的正常菌群之一，同时也是一种条件致病菌，能够引起人类食物中毒和动物坏死性肠炎的食源性疾病。《饮用天然矿泉水》（GB 8537-2018）标准对产气夹膜梭菌的要求是，从一批样品中采集5件样品，每件样品的采样量是50mL，均不得检出。《饮用天然矿泉水检验方法》（GB 8538-2016）规定，饮用天然矿泉水需检测产气荚膜梭菌，将其在亚硫酸盐-多粘菌素-磺胺嘧啶琼脂（简称SPS）培养基上经24h、36℃厌氧环境培养，计数滤膜上的黑色菌落，并取黑色可疑菌落做进一步的验证试验。但在这一环节会遇到一些不确定性因素，如目标菌在特定的时间内未生长、菌落颜色为灰色等，从而影响检测结果，不能真实反映样品中产气荚膜梭菌的存在情况。经试验证实，延长培养时间，增加活化的步骤，关注試验细节，可以解决试验中遇到的类似问题。

一、存在的问题

1.在实际检验过程中发现，完全按照GB 8538-2016的方法进行检验，滤膜上截留的产气荚膜梭菌在SPS培养基上经36℃厌氧培养24h，并无明显的黑色菌落，这就容易误认为被检样品中不含产气荚膜梭菌，而导致漏检。

2.对确定含有产气荚膜梭菌的样品进行检测后发现滤膜无黑色菌落产生，只有少量灰色的菌落，再对其进行确证试验，但生化现象不明显，最终给出错误的实验结果。

二、解决的方法

将产气荚膜梭菌标准菌株CICC22949接种于血平板上，经36℃厌氧培养，待长出明显菌落，挑取单菌落于液体硫乙醇酸盐培养基（简称FT），经36℃厌氧培养24h，用于后续试验。

1.延长培养的时间。根据GB 8538-2016中的方法对产气荚膜梭菌进行检测试验，将上述的FT培养液用0.85%的无菌生理盐水连续梯度稀释，配制成浓度分别为10CFU/mL、102CFU/mL、103CFU/mL、104CFU/mL、105CFU/mL的菌悬液，分别吸取1mL稀释后的菌悬液，加入到50mL的无菌天然饮用矿泉水中作为人工污染样品。将不同浓度的样品分别过0.22μm的滤膜，将滤膜紧贴于SPS培养基上，经36℃厌氧培养24h，不同浓度的菌悬液在SPS培养基上均未发现有生长迹象。针对该情况，本试验延长了培养时间，分别在36h、48h、60h、72h进行观察，结果发现，在48h后SPS培养基上有菌落生长，但不是标准要求的黑色菌落，而是灰色菌落，菌落数呈现梯度增长趋势。

挑取灰色菌落进行确证试验，结果表明，革兰氏染色为阳性粗大杆菌，在牛乳培养基中的生长繁殖速度极快，能够分解乳糖产酸，将酪蛋白凝固，同时产生大量的气体，冲散酪蛋白，使其呈海绵状，即“暴烈发酵”现象，如图1所示。由于产气荚膜梭菌无鞭毛，不运动，硝酸盐动力试验无动力（穿刺线周围没有扩散），硝酸盐被还原变为红色，如图2所示。产气荚膜梭菌产生卵磷脂酶，分解卵黄中的卵磷脂，卵黄培养基接种点的底部及周围有明显的乳白色浑浊带，如图3所示。

2.增加活化的步骤。挑取生长的菌落用FT培养后，再接入FT培养基培养24h，然后进行确证试验。试验中发现，直接挑取SPS生长的菌落于FT培养基后，确证性试验结果不明显，如硝酸盐动力试验不明显，含铁牛乳培养基“暴烈发酵”现象不明显。基于此，试验中将FT培养液继续接入FT培养基培养后，再进行确证试验。结果表明，再次被活化的菌在进行确证试验时，硝酸盐动力试验无动力（不扩散）、硝酸盐被还原变为红色;含铁牛乳培养基“暴沸”;卵黄培养基接种点的底部及周围有明显的乳白色浑浊带。

3.易被忽略的问题。配制好的FT培养基在试验临用前要隔水煮沸10min，以驱除培养基中溶解的氧气。这一点往往会被许多实验者忽略，进而影响到后续试验。采用未进行煮沸的FT培养基，在培养过程中不易观察产气现象;挑取菌落于煮沸后的FT培养基中，会观察到明显的气泡不断涌出，产气现象明显。

三、结论

产气夹膜梭菌是一种厌氧菌，活力不同对试验结果会有不同的影响。（1）新购入的标准菌株经活化后，在SPS培养基上24h后生长出黑色菌落，且具有较强活力。（2）制成FT培养菌液，在4℃条件下放置2-3d后接种到SPS培养基，24h后无菌落生长;延长培养时间到48h-72h时，SPS平板上可观察到菌落生长，且颜色为灰色。（3）将放置的FT培养菌液重新接入FT培养基培养24h后，再接种到SPS培养基，24h后生长出黑色菌落。

综上所述，若产气夹膜梭菌活力较弱，按标准GB 8538-2016的要求，24h内可能不会生长，会出现假阴性结果。因此，在实际的试验过程中可以延长产气夹膜梭菌的培养时间，增加活化的步骤，以此来避免漏检的可能性。