CC类趋化因子配体2对结核分枝杆菌感染人单核巨噬细胞THP-1自噬的影响及分子机制

李秀萍，王 玲，王 馨，严晓芸，董 力

结核病是一种严重的传染病，由结核分枝杆菌感染引起，对人类健康构成了巨大威胁。有流行病学统计数据显示，近年来我国结核病病例显著增加[1]。有研究表明，结核分枝杆菌是一种细胞内病原体，可寄生于宿主巨噬细胞，通过调控炎症反应及吞噬体酸化、成熟等不同机制调节宿主细胞死亡[2]。巨噬细胞能够杀灭微生物，但结核分枝杆菌仍然能够克服巨噬细胞的杀微生物机制而存活并复制[3]。自噬促进受损细胞器和错误折叠蛋白质降解，在抗菌防御机制中起着关键作用。重要的是，自噬既可以调节宿主对分枝杆菌感染的抗性，又可以控制细胞的存活[4]。CC类趋化因子配体2(CCL2)是一种调节单核细胞和巨噬细胞向感染部位迁移和渗透的关键趋化因子，其水平与结核病严重程度相关[5]。有研究显示，CD44能够促进结核分枝杆菌感染巨噬细胞中CCL2的表达[6]。还有研究表明，CCL2参与调节角质形成细胞的自噬[7]。然而，现临床尚未确定CCL2对结核分枝杆菌感染巨噬细胞自噬的影响。因此，本研究探讨CCL2对结核分枝杆菌感染人单核巨噬细胞THP-1自噬的影响及分子机制，以期为结核病的防治提供实验基础。

1 材料与方法

1.1细胞株和主要试剂 结核分枝杆菌H37Rv株和人单核巨噬细胞THP-1(美国ATCC)；RPMI 1640培养基和青-链霉素双抗(美国HyClone)；胎牛血清(美国Gibco)；Lipofectmine 2000转染试剂(美国Invitrogen)；TRIzol试剂(北京索莱宝)；PrimeScript RT试剂盒和Green Premix Ex Taq Ⅱ(日本TaKaRa)；CCL2 siRNA和siRNA control(广州锐博生物)；CCL2、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、p62、p65、IKK-α和IκB-α单克隆抗体及辣根过氧化物酶标记的二抗(美国CST)；RIPA裂解液(上海碧云天)；SDS-PAGE凝胶制备试剂盒、BCA蛋白浓度测定试剂盒和ECL化学发光试剂盒(赛默飞世尔)。

1.2细胞培养 THP-1细胞复苏后在含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液加1%青-链霉素双抗中进行培养，于37 ℃、5%CO2、饱和湿度的培养箱进行培养，观察细胞生长状态并及时更换培养液，采用胰蛋白酶消化细胞并传代处理，选取生长状态良好的细胞进行后续实验。

1.3H37Rv感染THP-1细胞 将传代的THP-1细胞接种到6孔板中，接种密度为1×106/ml，向每孔中加入浓度为150 ng/ml的佛波酯(PMA)(美国Sigma公司)溶液，37 ℃培养箱诱导培养24 h，去上清，PBS冲洗3次，再向每孔中添加2 ml无血清无双抗的培养液，将H37Rv以MOI=5感染细胞[8]，37 ℃培养箱感染4 h，弃上清，更换成新的培养液，此时记为感染0 h，测定CCL2 mRNA和蛋白表达，随后分别在感染6、12、24和48 h时测定CCL2 mRNA和蛋白表达。

1.4细胞转染和分组处理 待THP-1细胞贴壁良好，根据Lipofectmine 2000转染试剂使用说明书分别将CCL2 siRNA或siRNA control转染至THP-1细胞，转染6 h后更换完全培养液，实验分为Mock(对照)组、H37Rv(感染)组、H37Rv+si-NC(降低CCL2感染对照)组和H37Rv+si-CCL2(降低CCL2感染)组，其中H37Rv+si-NC组和H37Rv+si-CCL2组的THP-1细胞于转染48 h后，将H37Rv以MOI=5进行感染，并在H37Rv+si-CCL2组中添加浓度为150 ng/ml的NF-κB信号通路激活剂PMA进行干预作为H37Rv+si-CCL2+PMA组，24 h后分别收集各组细胞进行相关指标的检测。

1.5RT-PCR检测CCL2 mRNA表达量 使用TRIzol试剂分离待测各组THP-1细胞中总RNA，使用PrimeScript RT试剂盒对RNA进行逆转录，按照使用说明书采用Green Premix Ex Taq Ⅱ进行RT-PCR检测。以GAPDH为内参，采用2-ΔΔCt分析CCL2 mRNA表达量。GAPDH上游引物：5'-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3'，下游引物：5'-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3'。CCL2上游引物：5'-GCTCCGGGCCCAGTATCT-3'，下游引物：5' -ACAGGGAAGGTGAAGGGTATGA-3' 。

1.6Western blot检测CCL2、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、p62、p65、IKK-α和IκB-α蛋白表达量 将待测THP-1细胞在裂解缓冲液中裂解以提取总蛋白。使用BCA蛋白浓度测定试剂盒检测蛋白质浓度，随后将蛋白质用15%SDS-PAGE分离，然后转移到PVDF膜上。用5%脱脂牛奶封闭后，将膜与一抗(CCL2、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、p62、p65、IKK-α和IκB-α均为1∶1000稀释)在4 ℃下孵育过夜，然后将膜与二抗(1∶3000稀释)一起孵育2 h。使用ECL化学发光试剂盒显影，采集图像获得条带，以GAPDH进行标定，使用Image J软件分析目的蛋白相对表达水平。

1.7菌落形成单位计数分析H37Rv胞内存活率 将降低CCL2表达的THP-1细胞以2×105/孔接种到6孔板中，贴壁后将H37Rv以MOI=5进行感染，6 h后弃上清，PBS冲洗3次，加入含20 μg/ml阿米卡星(山东齐鲁制药有限公司)的培养液，杀死未进入细胞的H37Rv，在第4天以0.1%的Triton X-100裂解细胞，以10倍梯度稀释，涂布在7H11平板中，在37 ℃培养箱培养3周，进行菌落计数分析H37Rv胞内存活率。

2 结果

2.1H37Rv感染THP-1细胞中CCL2表达 H37Rv感染THP-1细胞不同时间CCL2 mRNA和CCL2蛋白总体比较差异有统计学意义(P<0.01)。H37Rv感染THP-1细胞6 h CCL2 mRNA和CCL2蛋白开始逐渐升高，随着感染时间延长CCL2 mRNA和CCL2蛋白持续升高，于24 h达到最高水平，48 h又有所降低。H37Rv感染THP-1细胞不同时间CCL2 mRNA和CCL2蛋白两两比较差异均有统计学意义(P<0.01)。见表1和图1。后续实验选择感染时间为24 h。

表1 不同时间H37Rv感染THP-1细胞中CCL2表达比较

图1 不同时间H37Rv感染THP-1细胞中CCL2蛋白表达

2.2CCL2在H37Rv感染THP-1细胞中转染效率 Mock组、H37Rv组、H37Rv+si-NC组和H37Rv+si-CCL2组4组H37Rv感染THP-1细胞中CCL2 mRNA和CCL2蛋白表达总体比较差异有统计学意义(P<0.01)。与Mock组比较，H37Rv感染THP-1细胞中CCL2 mRNA和CCL2蛋白表达H37Rv组和H37Rv+si-NC组均升高；与H37Rv组和H37Rv+si-NC组比较，H37Rv感染THP-1细胞中CCL2 mRNA和CCL2蛋白表达H37Rv+si-CCL2组降低，差异均有统计学意义(P<0.01)。见表2和图2。

表2 采用不同处理方式4组H37Rv感染THP-1细胞中CCL2表达比较

图2 采用不同处理方式4组H37Rv感染THP-1细胞中CCL2蛋白表达

2.3CCL2降低对H37Rv感染THP-1细胞自噬影响 Mock组、H37Rv组、H37Rv+si-NC组和H37Rv+si-CCL2组4组H37Rv感染THP-1细胞中LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ和p62表达总体比较差异有统计学意义(P<0.01)。与Mock组比较，H37Rv组和H37Rv+si-NC组H37Rv感染THP-1细胞中LC3-Ⅰ和p62表达升高，LC3-Ⅱ表达降低；与H37Rv组和H37Rv+si-NC组比较，H37Rv+si-CCL2组H37Rv感染THP-1细胞中LC3-Ⅰ和p62表达降低，LC3-Ⅱ表达升高，差异均有统计学意义(P<0.01)。见表3和图3。

图3 采用不同处理方式4组H37Rv感染THP-1细胞中LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ和p62表达比较

表3 采用不同处理方式4组H37Rv感染THP-1细胞中LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ和p62表达比较

2.4CCL2降低对H37Rv胞内存活影响 H37Rv组、H37Rv+si-NC组和H37Rv+si-CCL2组H37Rv胞内存活率分别为(100.00±9.22)%、(98.57±9.14)%和(46.88±4.52)%。3组H37Rv胞内存活率总体比较差异有统计学意义(P<0.01)。H37Rv组和H37Rv+si-NC组H37Rv胞内存活率明显高于H37Rv+si-CCL2组，差异有统计学意义(P<0.01)。

2.5CCL2对H37Rv感染THP-1细胞中NF-κB信号通路激活影响 Mock组、H37Rv组、H37Rv+si-NC组和H37Rv+si-CCL2组4组H37Rv感染THP-1细胞中p65、IKK-α和IκB-α表达总体比较差异有统计学意义(P<0.01)。与Mock组比较，H37Rv感染THP-1细胞中p65、IKK-α和IκB-α表达H37Rv组和H37Rv+si-NC组均升高；与H37Rv组和H37Rv+si-NC组比较，H37Rv感染THP-1细胞中p65、IKK-α和IκB-α表达H37Rv+si-CCL2组降低，差异均有统计学意义(P<0.01)。见表4和图4。

图4 采用不同处理方式4组H37Rv感染THP-1细胞中p65、IKK-α和IκB-α表达

表4 采用不同处理方式4组H37Rv感染THP-1细胞中p65、IKK-α和IκB-α表达比较

2.6PMA逆转CCL2降低对H37Rv感染THP-1细胞自噬影响 与H37Rv+si-CCL2组比较，H37Rv+si-CCL2+PMA组H37Rv感染THP-1细胞中LC3-Ⅰ和p62表达升高，LC3-Ⅱ表达降低，差异有统计学意义(P<0.01)，见表5和图5。

图5 H37Rv+si-CCL2组和H37Rv+si-CCL2+PMA组H37Rv感染THP-1细胞中LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ和p62表达

表5 H37Rv+si-CCL2组和H37Rv+si-CCL2+PMA组H37Rv感染THP-1细胞中LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ和p62表达比较

3 讨论

结核分枝杆菌感染肺部时，将导致结核病的发生，结核病是一种高病死率的传染病[9]。到目前为止，尚没有有效疫苗可以预防所有的结核分枝杆菌菌株，当前结核病的药物治疗面临耐药性的障碍，故现迫切需要弄清结核分枝杆菌感染的病理机制，以便可以确定有效的治疗靶标和诊断生物标志物[10]。在体内，结核分枝杆菌具有较长的潜伏期，这给结核病诊断和治疗带来了挑战，而及时的诊断和治疗对遏制结核病的传播具有重要意义。越来越多的研究表明，结核分枝杆菌可以改变基因表达，从而导致免疫逃逸[11-12]。以往研究发现，CCL2在肺结核患者中异常表达，提示它可能在肺结核发生和发展中起关键作用[13]。本研究结果发现，H37Rv感染THP-1细胞能够升高CCL2的表达，降低CCL2的表达可通过阻断NF-κB信号通路抑制H37Rv感染THP-1细胞自噬。

人体防御机制是病原体入侵研究必不可少的内容。自噬是许多类型病原体感染的关键防御机制[14]。自噬是维持细胞稳态的重要生理过程，可促进细胞存活，为抵抗微生物入侵的重要防御机制。然而，在分枝杆菌感染中，分枝杆菌利用自噬以确保其细胞内存活[15-16]。因此，在分枝杆菌感染中发现自噬过程背后的主要调节剂具有重要意义。本研究探讨CCL2对结核分枝杆菌感染巨噬细胞自噬的影响。首先，本研究评估了CCL2和结核分枝杆菌之间的关系，观察到结核分枝杆菌以时间依赖的方式升高CCL2的表达水平。接着，本研究确认由结核分枝杆菌改变的防御机制是否与CCL2的异常表达有关。然后，本研究探讨CCL2表达降低对巨噬细胞自噬及结核分枝杆菌存活的影响。值得注意的是，本研究发现CCL2表达降低增强了正常巨噬细胞自噬，并抑制结核分枝杆菌的存活。这一发现证实了结核分枝杆菌对细胞自噬的影响是通过CCL2表达降低实现的，这表明CCL2可能为肺结核提供了新的治疗靶点。以往研究显示，在结核病患者中NF-κB信号通路异常活化，且结核分枝杆菌感染后能够激活NF-κB信号通路[17-18]。有研究显示，大豆凝集素诱导的自噬通过产生活性氧并通过NF-κB信号通路发挥抗结核分枝杆菌的作用[19]。本研究结果同样发现，结核分枝杆菌感染的巨噬细胞中NF-κB信号通路关键蛋白p65、IKK-α和IκB-α表达升高，而降低CCL2能够有效抑制p65、IKK-α和IκB-α的表达。此外，NF-κB信号通路激活剂PMA能够逆转CCL2降低对结核分枝杆菌感染巨噬细胞自噬的抑制作用。以上结果表明CCL2可能通过抑制NF-κB信号通路调节结核分枝杆菌感染巨噬细胞自噬。

综上所述，结核分枝杆菌感染的巨噬细胞中CCL2表达升高，降低CCL2能够激活自噬并抑制结核分枝杆菌胞内存活，其作用机制与抑制NF-κB信号通路有关。CCL2似乎是结核分枝杆菌感染巨噬细胞中宿主防御机制的一部分，本研究结果有助于进一步了解细胞内稳态在防御细菌感染中的调控机制，为结核病的治疗提供实验基础。