miR-30-5p和SOCS1在食管癌组织中的表达及临床意义

黄 义，颜 彦，黄友军

食管癌是癌症相关死亡的重要原因之一，近年来食管癌发病率呈逐渐升高趋势，严重威胁人类健康[1]。种族因素、遗传因素和生活方式等在食管鳞状细胞癌的发生和发展中起重要作用。深入研究食管癌的发病原因和机制，早期诊断和治疗，对于延长食管癌患者生存时间意义重大。微小RNA(miRNA)是非编码、进化保守的短RNA，通过结合mRNA的3＇ 非翻译区(3＇ UTR)调控基因mRNA的稳定性调节基因表达，不仅可维持细胞正常生物学过程，还在肿瘤和炎症等疾病病理过程中发挥重要的作用[2]。miR-30-5p属于miR-30家族成员，有研究显示miR-30-5p在结直肠癌和胃癌等肿瘤中表达升高，促进转化生长因子-β1诱导的上皮间质转化，发挥促癌的生物学作用[3-4]。细胞因子信号传导抑制因子1(SOCS1)的编码基因位于人类16号染色体短臂，编码蛋白可以抑制细胞因子信号传导因子的生物学功能。有研究表明，SOCS1在人类肝细胞肝癌和卵巢癌等肿瘤中表达下降，诱导STAT3-Mcl1轴过度激活，促进肿瘤恶性进展[5-6]。Lin等[7]学者发现，SOCS1是miR-30家族的重要下游靶基因，miR-30家族成员能够抑制IFN/JAK/STAT信号通路的传导，导致病毒感染过程中的免疫逃逸。miR-30-5p和SOCS1在食管癌中的表达及相互关系现尚不清楚。本研究通过检测miR-30-5p和SOCS1在食管癌中的表达，初步探讨其临床意义,现报告如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2016年2月—2017年1月郴州市第一人民医院收治的符合纳入及排除标准接受手术治疗的食管癌85例作为研究对象。85例中男52例，女33例；年龄(53.4±6.2)岁；病程(3.5±1.2)个月;肿瘤位置：上胸段18例，中胸段40例，下胸段27例；肿瘤直径:≤5 cm 39例，>5 cm 46例；病理分级：高分化22例，中分化28例，低分化35例；肿瘤分期：Ⅰ期27例，Ⅱ期40例，Ⅲ期18例；淋巴结转移：有37例，无48例。本研究符合“赫尔辛基宣言”，经医院医学伦理委员会批准同意执行。自出院之日起对入选患者进行随访，以电话方式随访，每月1次，随访3年，随访截至2020年1月，随访终点为患者死亡或随访时间结束。

1.2纳入及排除标准 纳入标准：①初次就诊，无外院诊治史；②术前无放化疗等治疗史；③经病理检查明确诊断为食管癌；④无食管狭窄和反流性食管炎等食管良性疾病；⑤患者和(或)其家属对本研究知情同意并签署相关知情同意书。排除标准：①合并胃肠炎和肠结核等急性感染性疾病患者；②伴心肺功能衰竭患者；③伴免疫缺陷性疾病和精神障碍等患者。

1.3qRT-PCR检测组织中miR-30-5p和SOCS1 mRNA表达 取食管癌组织和癌旁组织(距离癌组织边缘2 cm以上)，液氮中研磨，Trizol法提取RNA，分光光度计检测RNA的浓度及纯度，OD 260/OD 280介于1.8～2.1。以RNA为模板进行逆转录，合成cDNA。以cDNA为模板，进行qRT-PCR。总体系20 μl，包括SYBR Green 10 μl，上下游引物各1 μl，cDNA 2 μl，双蒸水6 μl。miR-30-5p上游引物：5＇-AGTTGGACGAAGCAAATCCTC-3＇，下游引物：5＇-AGGTCGTGAGAGTAGCGACA-3＇;内参U6上游引物:5＇-TTCGGCAGCACATATACTAAAATTGG-3＇，下游引物:3＇-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-5＇；SOCS1 mRNA上游引物:5＇-CATTCAGACGGAGCGTGCTTAC-3＇，下游引物:5＇-TGCATCTTCATCTTCGTCAC-3＇；内参GAPDH上游引物:5＇-AGCCGACCGGTTCTGTCAT-3＇，下游引物:3＇-GGTCATAACCTGGTTCATCATCAC-5＇。miR-30-5p反应条件：94 ℃ 30 s，94 ℃ 5 s，62 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共35个循环。SOCS1 mRNA反应条件：95 ℃ 1 min，95 ℃ 20 s，58 ℃ 25 s，70 ℃ 30 s，共40个循环。miR-30-5p和SOCS1 mRNA的相对表达量以2-ΔΔCt值表示。以miR-30-5p和SOCS1 mRNA相对表达量的平均数1.850和0.875为界，分别将其分为高表达患者和低表达患者[5]。

1.4免疫印迹法检测组织中SOCS1蛋白表达 将食管癌组织和癌旁组织剪碎后匀浆器匀浆，离心去沉淀，取上清加入RIPA细胞裂解液，冰上裂解10 min。取上清BCA定量，加入SDS缓冲液，95 ℃金属浴10 min。后进行聚丙烯凝胶电泳：浓缩胶恒压80 V，分离胶恒压120 V，恒流300 mA转印90 min。5%脱脂牛奶中室温封闭2 h。SOCS1一抗(1∶1000，购自Abcam公司，货号：ab9870)4 ℃过夜；二抗(1∶5000)中孵育，室温1 h。电化学发光法显影照相，出现灰色条带则判定为蛋白阳性表达。

1.5观察指标 比较食管癌组织和癌旁组织中miR-30-5p及SOCS1 mRNA和蛋白表达，分析食管癌组织miR-30-5p和SOCS1 mRNA表达与食管癌患者临床病理特征关系，探讨食管癌组织中miR-30-5p和SOCS1 mRNA表达的相关性，预测食管癌组织中miR-30-5p和SOCS1 mRNA的结合位点，分析食管癌组织中miR-30-5p和SOCS1 mRNA不同表达与食管癌患者预后关系。

2 结果

2.1食管癌组织和癌旁组织中miR-30-5p及SOCS1 mRNA和蛋白表达 食管癌组织和癌旁组织中miR-30-5p的相对表达量分别为1.850±0.432和0.612±0.117，SOCS1 mRNA的相对表达量分别为0.875±0.120和2.143±0.635。食管癌组织中miR-30-5p相对表达量高于癌旁组织，而SOCS1 mRNA相对表达量低于癌旁组织，差异有统计学意义(P<0.01)，见图1a。食管癌组织和癌旁组织中SOCS1蛋白表达阳性率分别为12.9%(11/85)、94.1%(80/85)，SOCS1蛋白表达阳性率食管癌组织低于癌旁组织，差异有统计学意义(P<0.01)。SOCS1蛋白免疫印迹条带见图1b。

图1 食管癌组织和癌旁组织中miR-30-5p及SOCS1 mRNA和蛋白表达

2.2食管癌组织miR-30-5p和SOCS1 mRNA表达与食管癌患者临床病理特征关系 食管癌患者不同病理分级、肿瘤分期和有无淋巴结转移食管癌组织miR-30-5p和SOCS1 mRNA表达差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)；而食管癌患者不同性别、年龄、病程、肿瘤位置和肿瘤直径食管癌组织miR-30-5p和SOCS1 mRNA表达差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。

表1 食管癌组织miR-30-5p和SOCS1 mRNA表达与食管癌患者临床病理特征关系

2.3食管癌组织中miR-30-5p和SOCS1 mRNA表达相关性及结合位点预测 Pearson相关性分析结果显示，食管癌组织中miR-30-5p和SOCS1 mRNA表达呈明显负相关(r=-0.547,P<0.001)，见图2a。Target Scan Human 7.2生物信息软件预测食管癌组织中miR-30-5p和SOCS1 mRNA结合位点结果显示，SOCS1 mRNA序列3＇ UTR的285～292碱基位置处含有与miR-30-5p互补结合位点，见图2b。

图2 食管癌组织中miR-30-5p和SOCS1 mRNA表达相关性及结合位点预测

2.4食管癌组织中miR-30-5p和SOCS1 mRNA不同表达与食管癌患者预后关系 食管癌85例中无失访病例，随访3～36(27.1±6.2)个月，随访期间死亡53例，3年总体生存率为37.6%(32/85)。3年总体生存率食管癌组织中miR-30-5p高表达患者和低表达患者分别为19.0%(8/42)和55.8%(24/43)，SOCS1 mRNA高表达患者和低表达患者分别为56.1%(23/41)和20.5%(9/44)。Kaplan-meier生存分析结果显示，3年总体生存率食管癌组织中miR-30-5p高表达患者低于低表达患者，SOCS1 mRNA高表达患者高于低表达患者，差异有统计学意义(P<0.01)。见图3a和3b。

图3 食管癌组织中miR-30-5p和SOCS1 mRNA不同表达与食管癌患者预后关系

3 讨论

食管癌是起源于食管黏膜上皮的恶性肿瘤，我国每年食管癌新发病例约26万例，死亡病例约19万例，严重威胁人们身体健康[8]。食管癌早期常无明显临床表现，发现时多已处于中晚期，丧失手术治疗最佳时机，导致预后不良。食管癌的发生与多种因素有关，遗传因素和环境因素等共同作用促进食管癌的发生和发展[9]。探讨食管癌发病原因及机制，对食管癌的预防和临床新药研发等具有重要临床意义。

近年来，分子生物学研究不断发展，特别是分子靶向药物及免疫检查点药物等的临床应用为肿瘤治疗带来新的希望。细胞内的miRNA是调节细胞生物学行为的重要分子，长度19～23个核苷酸，成熟的miRNA与Dicer等构成RNA诱导的沉默复合物，结合并抑制靶基因mRNA的表达，调控细胞增殖、分化及衰老等生理病理过程[10-11]。有研究表明，肿瘤组织中多种miRNA表达异常，并影响肿瘤细胞的增殖和迁移等生物学行为，与肿瘤恶性进展密切相关[12]。miR-30-5p位于人类6号染色体，在多种人类肿瘤中异常表达，通过影响下游转录因子Snail下游信号通路的传导，发挥促进肿瘤发生和发展的生物学作用[13]。本研究结果显示，食管癌组织中miR-30-5p相对表达量高于癌旁组织，差异有统计学意义。miR-30-5p表达升高的具体机制现尚不清楚。Huang等[14]报道，miR-30-5p受到核因子κB(NF-κB)正调控作用的影响，肿瘤发生时NF-κB信号通路激活促进miR-30-5p表达升高。本研究结果还显示，食管癌患者不同病理分级、肿瘤分期和有无淋巴结转移食管癌组织miR-30-5p表达差异有统计学意义。表明食管癌组织miR-30-5p表达水平升高促进食管癌恶性进展。有研究报道，miR-30-5p表达升高能够直接激活Wnt信号通路的信号传导，促进肿瘤上皮间质转化过程，导致肿瘤细胞迁移和侵袭能力增强，造成肿瘤易发生淋巴结转移，病理分级和肿瘤分期增加[15]。

SOCS1属于细胞因子信号传导抑制因子家族的成员，其编码蛋白能够负性调控JAK/STAT信号通路[16-17]。SOCS1具有进化保守的Src同源域2结构域，是结合JAK并发挥负性调控功能的主要结构域[18-19]。有研究表明，SOCS1作为一种抑癌基因，在磷酸化激活后能够以二聚体的形式发挥生物活性功能，抑制肿瘤的进展[20]。本研究结果显示，食管癌组织中SOCS1 mRNA相对表达量低于癌旁组织，差异有统计学意义，分析其机制可能与转录后调控异常有关。Zhang等[21]研究表明，miR-155等非编码RNA能够与SOCS1 mRNA 3＇ UTR结合，并降解SOCS1 mRNA抑制SOCS1蛋白表达。本研究结果显示，食管癌患者不同病理分级、肿瘤分期和有无淋巴结转移食管癌组织SOCS1 mRNA表达差异有统计学意义。分析其机制可能是SOCS1 mRNA低表达导致与p53相互作用减弱，抑制p53抑癌基因功能，进而促进肿瘤G2/M期转换，加快肿瘤细胞增殖及转移等行为[22]。本研究Kaplan-meier生存分析结果显示，3年总体生存率食管癌组织中miR-30-5p高表达患者低于低表达患者，SOCS1 mRNA高表达患者高于低表达患者，差异有统计学意义。表明食管癌组织中miR-30-5p和SOCS1 mRNA表达水平对食管癌患者预后具有一定预测价值。有研究报道，miR-30-5p和SOCS1 mRNA表达水平能够影响顺铂类抗癌药物治疗的敏感性，体外细胞实验证实二者能够逆转化疗药物耐药性形成[23-24]。此外，本研究结果还显示，食管癌组织中miR-30-5p和SOCS1 mRNA表达呈明显负相关，SOCS1 mRNA序列3＇ UTR的285～292碱基位置处含有与miR-30-5p互补结合位点，提示SOCS1 mRNA可能受到miR-30-5p的靶向调控。Lin等[7]研究证实，miR-30家族能够抑制SOCS1的表达，进而促进下游IFN/JAK/STAT信号的传导。

综上所述，食管癌组织中miR-30-5p表达升高，而SOCS1 mRNA和蛋白表达降低，其与食管癌患者病理分级、肿瘤分期、有无淋巴结转移及预后有关，共同促进食管癌恶性进展。miR-30-5p和SOCS1有望作为评估食管癌患者预后的肿瘤标志物，但二者在食管癌中的相互作用机制及临床应用有待深入研究。