miR-100-5p对胃癌细胞增殖、转移和化疗耐药的作用及机制研究

雷 益，李绍军，胥钱平，冯 成，杜丽英

胃癌是常见恶性肿瘤，为与肿瘤相关死亡的第三大原因，2018年估计有783 000例胃癌患者死亡[1]。化疗、放疗和胃切除术是治疗胃癌的主要方法，尽管近年这些治疗方法的实施取得了长足进步，但胃癌晚期患者总体5年生存率仍不到30%[2]。目前，晚期转移和化疗耐药仍是胃癌患者治疗的主要障碍[3]。因此，胃癌分子机制研究是探讨胃癌新治疗策略的重要途径。miRNA是非编码RNA之一，虽然不具备编码功能，但是其在肿瘤等疾病中的作用逐渐被挖掘[4]。miR-100-5p是与肿瘤密切相关的miRNA之一，可发挥抑癌作用和促癌作用。有研究显示，miR-100-5p在前列腺癌、肝细胞肝癌和非小细胞肺癌等肿瘤中表达异常，不仅与肿瘤增殖和转移密切相关，还可调控肿瘤细胞耐药[5-7]。Chen等[8]报道miR-100-5p通过抑制mTOR信号通路参与长链非编码RNA HAGLROS促进胃癌恶性进展，但是miR-100-5p在胃癌中的表达及发挥的具体生物学功能现仍未知。因此，本研究探讨miR-100-5p对胃癌细胞增殖、转移和化疗耐药的作用及机制，旨在获得miR-100-5p抗胃癌治疗的潜在分子靶点。

1 材料与方法

1.1一般资料 选取2017年1月—2019年6月于四川大学华西医院眉山医院行根治性手术的胃癌患者标本，收集经病理检查证实的胃癌组织和癌旁组织(距离肿瘤5 cm的非胃癌组织)，患者术前未接受过任何形式治疗并签署相关知情同意书，共纳入70例。70例中男37例，女33例；年龄≤60岁28例，>60岁42例；肿瘤直径：<5 cm 50例，≥5 cm 20例；分化程度：高分化12例，中分化15例，低分化43例；淋巴结转移：有39例，无31例；Duke分期：Ⅰ期18例，Ⅱ期20例，Ⅲ期24例，Ⅳ期8例。患者术后进行以铂类为主的一线化疗，化疗方案为奥沙利铂第1天和第7天100 mg/m2静脉滴注2 h，7 d为1个疗程，共化疗5个疗程。随访追踪患者治疗后效果，主要包括复发和疾病进展，70例中化疗有效37例，无效33例。

1.2试剂和材料 Trizol试剂购自美国Invitrogen公司，RNA提取试剂盒和qRT-PCR试剂盒购自北京百奥莱博科技有限公司，miR-100-5p和内参U6引物由上海生工试剂公司合成，胰蛋白酶、细胞培养基和胎牛血清购自美国Hyclone公司，胃癌细胞系GES-1、MKN1、MKN45及人正常胃黏膜上皮细胞系RGM-1购自中国科学院细胞库，miR-100-5p mimic购自广州瑞博生物试剂有限公司，MTS试剂和BCA蛋白浓度检测试剂盒购自上海碧云天生物试剂有限公司，Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒购自南京凯基生物技术有限公司，RIPA裂解液购自上海贝博生物科技公司，PVDF膜购自美国Bio-Rad，ERK1/2、pERK1/2和GAPDH抗体购自美国Cell Signaling公司，ECL化学发光试剂盒购自上海慧颖生物科技有限公司。

1.3qRT-PCR 在胃癌组织和癌旁组织中加入Trizol裂解液于研钵中研磨裂解，采用RNA提取试剂盒提取组织中总的RNA。采用UltraRT One-step RT-PCR试剂盒进行RNA逆转录和qRT-PCR，其体系为10X One Step RT-PCR Buffer 1 μl、上下游引物各0.4 μl、RNA 0.2 μg、RNase mimic 0.1 μl、AMV RT 0.1 μl、Taq DNA polymerase和无RNA酶的双蒸水补足10 μl。反应条件为逆转录45 ℃20 min、94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s、60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s 30个循环，72 ℃终延伸10 min。miR-100-5p引物F：5'-GAACCCGTAGATCCGAACT-3'，R：5'-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3'；U6引物F：5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，R：5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。按照2-ΔΔCt公式以U6为内参计算miR-100-5p的相对表达量。

1.4细胞培养和细胞转染 采用含有10%胎牛血清的培养基培养胃癌细胞系GES-1、MKN1、MKN45及人正常胃黏膜上皮细胞系RGM-1，并放置在37 ℃含有5%CO2的全湿度培养箱中。采用胰酶消化进行细胞传代。细胞长满时收集细胞，提取细胞总RNA。采用qRT-PCR检测各细胞中miR-100-5p的表达。选取miR-100-5p表达最低的细胞系进行细胞接种，以每孔2×105个细胞接种至6孔板中，分为NC组和miR-100-5p mimic组，细胞贴壁12 h后进行细胞转染，NC组转染脂质体2000与对照mimic混合液，miR-100-5p mimic组转染脂质体2000与miR-100-5p mimic混合液，转染培养48 h后采用qRT-PCR检测细胞中miR-100-5p的表达。

1.5MTS实验检测细胞增殖能力 NC组和miR-100-5p mimic组细胞以每孔2000个接种至96孔板中，每组设置6个重复孔，分别在贴壁0、24、48和72 h时，每孔更换100 μl培养基和20 μl MTS试剂，继续在培养箱中培养2 h，采用全波长扫描仪检测细胞在490 nm处的OD值。

NC组和miR-100-5p mimic组细胞以每孔2000个接种至96孔板中，每组设置6个重复孔，细胞贴壁后分别加入不同剂量的奥沙利铂(0、5、10、20、40、80、160和320 μmol/L)处理细胞48 h。每孔更换100 μl培养基和20 μl MTS试剂，继续在培养箱中培养2 h，采用全波长扫描仪检测细胞在490 nm处的OD值。细胞增殖率=miR-100-5p mimic组平均OD值/NC组平均OD值×100%。

1.6Transwell实验检测细胞转移能力 NC组和miR-100-5p mimic组细胞胰酶消化后，无血清培养基洗3次，以每孔1×105个接种至24孔板Transwell小室膜中，24孔板Transwell下室中加入含有500 μl 10%胎牛血清的培养基，每组设置3个重复孔，培养箱中培养10 h，细胞可穿过Transwell小室膜贴在膜下室面，终止细胞培养。膜下室面细胞经PBS洗3次、甲醇固定及吉姆萨染色后在显微镜下计数细胞穿膜数目。

1.7流式细胞凋亡实验检测细胞凋亡率 NC组和miR-100-5p mimic组细胞经无EDTA的胰酶消化后，PBS洗3次，以每管5×105个收集到流式细胞管中，按照凋亡染色试剂盒说明书，加入500 μl染色缓冲液、5 μl Annexin V-FITC和5 μl PI细胞重悬混匀。常温孵育10 min进行染色，流式细胞仪上机检测细胞凋亡率。

NC组和miR-100-5p mimic组细胞经奥沙利铂不同浓度处理48 h后，经无EDTA的胰酶消化后，PBS洗3次，以每管5×105个收集到流式细胞管中，按照凋亡染色试剂盒说明书，加入500 μl染色缓冲液、5 μl Annexin V-FITC 和5 μl PI细胞重悬混匀。常温孵育10 min进行染色，流式细胞仪上机检测细胞凋亡率。

1.8Western blotting检测ERK1/2和pERK1/2蛋白表达 NC组和miR-100-5p mimic组细胞收集后加入RIPA裂解液，于冰上裂解细胞30 min，14 000 r/min 4 ℃离心30 min后，获得细胞总蛋白。采用BCA蛋白浓度检测试剂盒检测蛋白浓度，加入蛋白上样缓冲液混匀后煮沸变性。蛋白80 V凝胶电泳2 h、350 mA湿转2 h、5%封闭液室温封闭1 h，与ERK1/2和pERK1/2一抗(稀释度均为1∶500)4 ℃孵育过夜，二抗室温孵育2 h，采用ECL化学发光试剂盒进行蛋白条带曝光。

2 结果

2.1胃癌组织和癌旁组织中miR-100-5p表达 qRT-PCR检测结果显示，miR-100-5p在胃癌组织和癌旁组织中的相对表达量分别为1.05±0.36和1.69±0.72，miR-100-5p的相对表达量胃癌组织低于癌旁组织，差异有统计学意义(P<0.01)，见图1。

图1 qRT-PCR检测胃癌组织和癌旁组织中miR-100-5p相对表达量

2.2miR-100-5p表达与胃癌患者临床病理参数关系 miR-100-5p表达与胃癌患者性别、年龄、肿瘤直径和分化程度无关(P>0.05)；与胃癌患者淋巴结转移、TNM分期和化疗效果相关(P<0.05或P<0.01)，见表1。

表1 miR-100-5p表达与胃癌患者临床病理参数关系

2.3胃癌细胞系及人正常胃黏膜上皮细胞系中miR-100-5p表达 qRT-PCR检测结果显示，miR-100-5p在胃癌细胞系GES-1、MKN1、MKN45及人正常胃黏膜上皮细胞系RGM-1中的相对表达量分别为1.31±0.14、1.34±0.15、0.39±0.07和2.94±0.29。miR-100-5p相对表达量胃癌细胞系GES-1、MKN1、MKN45及人正常胃黏膜上皮细胞系RGM-1总体比较差异有统计学意义(P<0.01)；miR-100-5p相对表达量胃癌细胞系GES-1、MKN1和MKN45均低于人正常胃黏膜上皮细胞系RGM-1，差异有统计学意义(P<0.01)。见图2。

图2 qRT-PCR检测胃癌细胞系及人正常胃黏膜上皮细胞系中miR-100-5p相对表达量

2.4miR-100-5p mimic转染效果 miR-100-5p mimic转染胃癌细胞MKN45，qRT-PCR检测结果显示，NC组和miR-100-5p mimic组细胞中miR-100-5p相对表达量分别为1.00±0.06和5.42±0.27。细胞中miR-100-5p相对表达量miR-100-5p mimic组高于NC组，差异有统计学意义(P<0.01)。见图3。

图3 qRT-PCR检测miR-100-5p mimic转染效果

2.5miR-100-5p对MKN45细胞增殖能力影响 MTS实验检测结果显示，MKN45细胞增殖能力miR-100-5p mimic组低于NC组，差异有统计学意义(P<0.05)，见图4。

图4 MTS实验检测miR-100-5p对MKN45细胞增殖能力影响

2.6miR-100-5p对MKN45细胞转移能力影响 Transwell实验检测结果显示，MKN45细胞穿膜细胞数NC组和miR-100-5p mimic组分别为(49.33±7.35)个和(21.67±5.84)个，MKN45细胞穿膜细胞数miR-100-5p mimic组少于NC组，差异有统计学意义(P<0.01)，见图5。

图5 Transwell实验检测miR-100-5p对MKN45细胞转移能力影响(吉姆萨染色×100)

2.7miR-100-5p对MKN45细胞奥沙利铂化疗敏感性影响 NC组和miR-100-5p mimic组MKN45细胞经不同浓度奥沙利铂处理，培养48 h后MTS实验检测结果显示在同一奥沙利铂浓度处理下，细胞增殖率miR-100-5p mimic组低于NC组,差异有统计学意义(P<0.05)。流式细胞凋亡实验检测结果显示，NC组细胞凋亡率为(2.14±0.15)%，miR-100-5p mimic组细胞凋亡率为(7.06±0.27)%。MKN45细胞对奥沙利铂化疗敏感性miR-100-5p mimic组较NC组增加，差异有统计学意义(P<0.05)。见图6。

图6 miR-100-5p对MKN45细胞奥沙利铂化疗敏感性影响

2.8miR-100-5p对MKN45细胞ERK1/2信号通路影响 Western blotting检测结果显示，NC组和miR-100-5p mimic组细胞中ERK1/2蛋白比较差异无统计学意义(P>0.05)；细胞中pERK1/2蛋白表达miR-100-5p mimic组低于NC组，差异有统计学意义(P<0.05)，见图7。

图7 miR-100-5p对MKN45细胞ERK1/2信号通路影响

3 讨论

胃癌是一种侵袭性疾病，性质具有多样性[1]。在过去的几十年中，胃癌在全球范围内发病率有所下降，但在我国人群中却在上升，我国胃癌的发病率和病死率位居所有肿瘤第2位[9]。因此，寻求胃癌有效治疗方法至关重要。手术切除是早期无远处转移或局部区域转移胃癌患者最有效治疗方法。然而，对于晚期胃癌患者，即使完全切除肿瘤并进行辅助化疗，但由于转移和化疗耐药导致预后也很差[2]。目前,幽门螺杆菌感染、高盐摄入和吸烟被认为是胃癌发生和发展的主要危险因素[10]，但是胃癌的发生和发展相关分子机制现尚未完全明确。因此，阐明胃癌转移和化疗耐药等肿瘤恶性进展的分子机制非常迫切。

miRNA是一类长度为17～25 nt的非编码RNA，可通过靶基因与3' -UTR互补结合在转录后水平抑制mRNA，参与各种生理和病理过程。高度保守的miRNA在调节细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡等肿瘤进程中发挥重要作用[4]。越来越多的研究表明，miRNA失调在胃癌的发生和发展中具有重要意义[11]。miR-100-5p是miRNA家族的重要成员，位于11q24.1号染色体上，具有高度保守性。有研究报道miR-100-5p高表达是口腔鳞状细胞癌预后不良的分子标志物[12]。在肾细胞癌中miR-100-5p表达上调，并促进肿瘤细胞的增殖和转移，抑制肿瘤细胞的凋亡[13]。然而，有学者报道miR-100-5p在肝细胞癌中表达下调与患者预后较差有关[6]。上述研究表明miR-100-5p具有肿瘤异质性，在不同肿瘤中具有不同功能。miR-100-5p在胃癌中的表达情况以往文献未见报道，本文采用qRT-PCR检测发现miR-100-5p相对表达量胃癌组织低于癌旁组织，胃癌细胞系GES-1、MKN1、MKN45均低于人正常胃黏膜上皮细胞系RGM-1；并且miR-100-5p表达与胃癌细胞患者淋巴结转移、TNM分期和化疗效果相关。提示miR-100-5p表达与胃癌细胞增殖和转移密切相关。本研究结果还显示，MKN45细胞增殖能力及MKN45细胞穿膜细胞数miR-100-5p mimic组低于或少于NC组，差异有统计学意义。表明miR-100-5p在胃癌中发挥抑癌作用。

化疗抵抗是肿瘤治疗受阻的重要原因之一[3]。有研究报道miR-100-5p在肿瘤细胞化疗耐药过程发挥关键作用。miR-100-5p在非小细胞肺癌中促进肿瘤耐药细胞对克唑替尼和洛拉替尼耐药，为耐药性的治疗靶标[14]。然而，另一项研究表明，miR-100-5p可促进肺癌细胞对顺铂的敏感性[7]。奥沙利铂是铂类化合物中的一种，比顺铂具有更显著的抗肿瘤作用，被广泛应用于胃肠道肿瘤的治疗，但对其耐药性极大影响了患者预后[15]。本文对miR-100-5p是否在胃癌细胞对奥沙利铂耐药过程发挥重要作用进行了研究，结果显示MKN45细胞对奥沙利铂化疗敏感性miR-100-5p mimic组较NC组增加，差异有统计学意义。说明过表达miR-100-5p的胃癌细胞对奥沙利铂的敏感性增加。本研究发现miR-100-5p抑制胃癌细胞的增殖、转移和化疗耐药，但是其具体作用机制仍需进一步探讨。ERK1/2信号通路对包括胃癌在内的肿瘤细胞增殖、转移和化疗耐药生物过程具有重要调控作用，pERK1/2促进肿瘤细胞增殖、转移和化疗耐药[16]。本研究Western blotting检测结果显示，NC组和miR-100-5p mimic组细胞中ERK1/2蛋白比较差异无统计学意义；细胞中pERK1/2蛋白表达miR-100-5p mimic组低于NC组，差异有统计学意义。表明miR-100-5p可能通过下调ERK1/2信号通路抑制胃癌细胞增殖、转移和对奥沙利铂耐药。

综上所述，miR-100-5p在胃癌细胞中低表达，并与胃癌患者淋巴结转移、TNM分期及化疗效果相关。miR-100-5p可能通过调控ERK1/2信号通路抑制胃癌细胞增殖、转移和对奥沙利铂化疗耐药，是治疗胃癌的潜在靶标。