储藏稻谷及糙米表面霉菌检测情况的分析比较

田 琳 张海洋 祁智慧 唐 芳

(国家粮食和物资储备局科学研究院，北京 100037)

稻谷是我国重要的储备粮品种，其储藏安全受多种因素的影响。霉菌生长引起粮堆霉变发热，甚至产生毒素，是导致稻谷数量和质量损失、引发储藏安全问题的主要因素之一[1-3]。霉菌生长的早期检测是霉变防控的基础[4]，只有尽早发现，才能及时有效处理，将储粮损失降到最低。

储粮霉菌检测方法多样，原理各不相同，大体可分为直接检测法和间接检测法两大类。直接法主要包括平板菌落培养计数、真菌孢子计数法和电镜观察法等。储粮真菌多属丝状真菌，具有典型的孢子结构，通过检测粮食中真菌孢子数量的变化，可了解储粮中真菌生长情况。平板菌落培养计数法[5，6]是通过洗脱粮食上的真菌，对萌发形成菌落的真菌孢子进行观察计数，该方法操作繁琐且耗时长(一般需要5～7 d)；真菌孢子计数法是通过洗脱获得孢子，借助显微技术直接对真菌孢子进行观察计数[7，8]，克服了平板培养耗时长的问题；扫描电子显微镜作为一种超微结构的观察手段，通过观察粮食籽粒上霉菌孢子和菌丝生长分布情况，辅助观察和判定稻谷霉变程度[9]，可以作为储粮霉菌生长情况研究较为直观的对照方法。间接法主要通过检测储粮霉菌细胞特定成分[10-12]、真菌酶类[13-15]、挥发性物质[16，17]及能量代谢产物等[18-20]间接反映霉菌生长情况。间接法因操作复杂、检测仪器昂贵，在实际储粮中很少应用，只有基于能量代谢的粮温检测技术被广泛应用，但对于储粮霉菌的检测有严重的滞后性[21-23]。近年来，粮堆CO2气体检测技术逐渐被重视，但受粮堆生态系统中其他生物代谢或储粮工艺的干扰较大，检测结果虽可判断粮堆是否有异常变化，但不能直接用于判定霉菌生长情况。因此，在实际储粮中，操作简单、快速的直接检测方法仍是必需的。

本研究在15～35 ℃的恒温培养箱中对含水量为14.6%的优质粳稻进行了模拟储藏实验，采用扫描电镜观察赋值法、真菌孢子计数法和平板菌落培养计数法三种直接方法(分别简称为电镜赋值法、孢子计数法和平板培养法)定期检测稻谷表面和糙米表面的霉菌生长状况，总结了不同储藏温度下稻谷和糙米表面霉菌的生长规律，并对检测方法的操作过程和检出结果等方面进行分析，比较其优缺点。

1 材料与方法

1.1 实验材料

稻谷样品：2017年产优质粳稻，初始含水量14.6%，产自吉林榆树。

1.2 主要仪器

HPS-250生化培养箱，PL3002-IC 电子分析天平，DJSFM-1粮食水分测试粉碎磨，HG-9246A型电热恒温鼓风干燥箱，JDMZ 100 稻谷出米率检测仪，HERAsafe KS12 生物安全柜，MLS-3781L-PC高压蒸汽灭菌器，E1010离子溅射仪，S-3000N扫描电子显微镜。

1.3 实验方法

1.3.1 样品处理

准备5个8 L密封箱，清洗、晾干后，75%酒精消毒处理。称取清理、除杂的稻谷样品装入5个密封箱中，每箱装入4 kg。密封箱分别放置在15、20、25、30、35 ℃生化培养箱中储藏180 d，储藏期间定期取样检测稻谷和糙米上霉菌的生长情况。

1.3.2 稻谷水分检测

储藏期间每30 d 在各密封箱中随机取样，按照GB 5497—85[24]中105 ℃的恒重法测定稻谷水分。

1.3.3 电镜赋值法检测

每30 d 在各密封箱中随机取样约20 g，随机选出8粒作为扫描电镜观察样品，其中4粒通过手工剥壳制成糙米。4粒稻谷和4粒糙米经离子溅射仪喷金处理后，在扫描电镜下观察(放大倍数300倍)并记录霉菌孢子及菌丝的生长情况。

为了量化分析检测结果，对稻谷或糙米表面按观察到霉菌孢子或菌丝的状态进行污染程度分级(k)、区域划分、并赋值(Vk)处理，具体方法如下：未观察到霉菌孢子和菌丝的区域，污染程度定义为0级，不做标记并赋值0；观察到零星分布的霉菌孢子的区域，污染程度定义为一级，赋值20(见图1a)；观察到密度较高但零散分布的孢子和菌丝的区域，污染程度定义为二级，赋值 40(见图1b)；观察到聚集性分生孢子和分生孢子梗结构的区域，污染程度定义为三级，赋值70(见图1c)；观察到成堆的霉菌孢子及菌丝的区域，污染程度定义为四级，赋值100(见图1d)。在观察过程中，评估霉菌孢子和菌丝污染等级(Vk)及其所占的面积百分比(Sk)。赋值结果(V)定义为污染等级面积百分比与等级赋值乘积之和。

图1 扫描电镜下观察结果分级赋值依据

1.3.4 孢子计数法检测

每10 d 在各密封箱中随机取样，采用 LS/T 6132—2018 《粮油检验储粮真菌的检测孢子计数法》[8]检测稻谷表面携带霉菌孢子数量(FSN/g)。采取手工分离稻壳和糙米的方式，获得10 g糙米，参照上述方法对糙米携带的霉菌孢子进行振荡洗脱并检测，根据稻谷的出糙率数据将结果换算成每克稻谷携带的霉菌孢子数量。

1.3.5 平板培养法检测

收集实验初始样品和各温度下储藏180 d的稻谷样品，参照GB 4789.15—2016[6]，使用高盐察式培养基(氯霉素含量200～400 mg/L)，培养并检查稻谷中携带的霉菌情况，结果使用菌落形成单位/克(CFU/g)表示。

设置碾米时间30 s，对上述稻谷样品用稻谷出米率检测仪处理，收集碾米过程中的糠皮层，用糠皮层的带菌量表示糙米表面携带的霉菌情况，操作方法同上，对糠皮层进行培养，结果换算成每克稻谷的菌落形成单位。

1.4 数据处理

采用SPSS 19.0、EXCEL 2010软件处理数据。

2 结果与分析

2.1 稻谷储藏期间水分变化情况

实验收集到含水量为14.6%的优质粳稻，置于不同温度下模拟储藏180 d，期间稻谷水分变化见图2。

图2 储藏期间稻谷水分变化情况

由图2可知，稻谷水分随储藏温度而变化，温度越高水分丢失越严重。除35 ℃外，其他温度条件下模拟储藏前90 d稻谷水分变化幅度不大，90 d后由于储藏环境进入低湿度的秋冬季节，环境相对湿度由60%左右下降至20%左右，即使储藏在密闭的塑料箱中，每次因取样等开箱操作均会造成不同程度的水分损失。

2.2 电镜赋值法检出情况

机械砻谷脱壳过程中，由于机械摩擦振动或风力作用，会引起真菌的产孢结构及孢子脱落，造成孢子数量减少，不能真实反映糙米表面霉菌的自然生长状态[9]，因此本实验检测所用的糙米均采用手动剥除稻壳，尽量降低稻壳对糙米表面霉菌的影响。

按照方法1.3.3的方法，对稻谷和糙米样品观察并赋值。初始样品和15 ℃条件下，储藏180 d各样品的在稻谷和糙米表面均未观察到霉菌孢子和菌丝结构，表明15 ℃低温能有效抑制霉菌生长。其他温度条件下的赋值结果见图3。

由图3可知，无论是稻谷表面还是糙米表面，霉菌赋值随储藏温度的升高呈上升趋势，表明适宜生长条件下，霉菌生长速度与储藏温度呈正相关。由图中霉菌起始检出点可知，20、25、30 ℃和35 ℃的储藏条件稻谷样品中开始检出霉菌孢子或菌丝的时间分别为90、60、30 d和30 d，表明在一定的温度范围内霉菌起始生长时间随储藏温度升高而缩短。由图3中各曲线增长趋势可知，霉菌孢子在检出后都经历一段时间的快速增长，随后生长速度逐渐放慢或维持在一定水平，这与2.1中稻谷样品的水分降低密切相关。水分是储粮微生物生存的决定性条件，研究表明14.0%左右是真菌生长的临界水分，在此水分下，真菌生长缓慢或停滞[1,25]。由图2可知，20、25、30 ℃和35 ℃下样品分别在储藏150、120、120 d和60 d后降到14.0%及以下，与图3中各温度下霉菌生长最大值基本吻合。其中25 ℃及以上电镜赋值40以上，污染程度达到二级，对应真菌检测达到106个/g[9]，对储粮会造成一定的危害。

图3 稻谷和糙米表面电镜赋值法霉菌检出情况

实际观察到稻谷表面的霉菌生长量明显多于糙米，因此稻谷表面赋值高于糙米表面。造成这种现象的原因，一是稻壳的天然保护作用，霉菌不容易侵入到粮粒内；二是储粮霉菌大部分具有好氧特性，趋于向稻壳外生长。

扫描电镜放大倍数和分辨率高，可清晰的区分出糙米的胚和胚乳，因此，单独赋值并计算。由图3可见，各温度下胚部和胚乳的赋值结果基本一致，胚部略高于胚乳，尤其是在30 ℃和35 ℃中后期，这是由于糙米胚部营养更丰富，更适于微生物的生长。

2.3 孢子计数法检出情况

因孢子计数法操作简单、耗时短，为更好地跟踪稻谷样品表面携带霉菌情况，稻谷的取样检测时间间隔设置为10 d。按1.3.4所述的方法，不同温度条件下，稻谷表面的霉菌孢子检测结果如图4所示。

图4 不同储藏时间稻谷表面孢子计数法霉菌检出情况

由图4可知，霉菌孢子开始检出的时间随储藏温度升高而逐渐缩短，在15～35 ℃条件下，分别是150、70、30、20和10 d。霉菌孢子起始检出时间早于电镜观察赋值法10～30 d。15 ℃条件下，储藏150 d 有少量检出，20 ℃条件下，储藏80 d开始有检出，120 d 后霉菌孢子数升至最高，之后基本保持不变，主要受其水分降低影响。15 ℃和20 ℃条件下，虽有霉菌孢子检出，但检出量水平低于106个/g，不足以对稻谷的品质造成危害[1，2]。25、30 ℃和35 ℃条件下，储藏初期水分和温度适于真菌生长，霉菌检出量分别在30、20 d和20 d达到106个/g以上，后期由于稻谷水分降低趋于平稳状态。由此可见，14.6%含水量的稻谷长期储存在25 ℃及以上，存在较大风险。

各温度下储藏180 d及25 ℃条件下不同储藏时间的稻谷和手剥糙米表面的霉菌生长对比情况如图5所示。

图5 稻谷和糙米孢子计数法霉菌检出情况比较

由图5可知，同一储藏时间(180 d)不同储藏温度和同一储藏温度(25 ℃)不同储藏时间，霉菌孢子在稻谷表面的检出量都大于糙米，基本相差1个数量级左右。此外，各温度下储藏180 d稻谷样品，15 ℃下稻谷表面有霉菌孢子检出，而糙米表面未检出；25 ℃下稻谷表面在30 d开始有霉菌孢子检出，而糙米表面开始检出时间在60 d。以上结果表明，稻壳能阻挡一部分霉菌孢子进入稻谷内，在加工过程中，脱壳处理能去除大部分的霉菌，将糙米的带菌量降低1个数量级左右。

2.4 平板培养法检出情况

平板菌落培养法是一种微生物检测的传统方法，该方法主要使用不同营养成分的固体培养基对样品中可培养的微生物进行分离培养，根据菌落形态及菌落数来检测微生物的数量及种类[5,26]。霉菌对储粮危害最大，而储粮霉菌普遍具有耐高渗透压的特性。因此，在本实验中采用高盐察式培养基对样品携带的霉菌进行培养。检测结果见图6。

图6 平板培养法霉菌检出情况(180 d)

由图6可知，稻谷和糠皮层初始样品的菌落形成单位(CFU/g)数量级分别在2.0和3.0左右，相差1个数量级范围。在25 ℃及以上温度储藏，稻谷和糠皮层的霉菌检出量出现增加且呈现缓慢增长趋势，且稻谷的检出量均高于糠皮层1～2个数量级。可见，稻壳对糙米起到了一定的保护作用。

2.5 三种检测方法比较分析

由2.2～2.4中三种方法的检测结果可见，在储藏150～180 d内霉菌的生长基本趋于稳定，且在实际储粮中霉菌的检测主要以稻谷原粮为主，因此，将不同温度下储藏180 d的稻谷样品经三种方法检出的结果进行Tukey检验，结果见表1。

由表1可知，随着储藏温度的升高，三种方法的检出量都呈增长的趋势，即储藏温度越高，检出量越大。电镜赋值法在初始样品和15 ℃下储藏样品中均无检出，在20 ℃和25 ℃下的检出量有显著性差异；孢子计数法在原始样品中无检出，各温度下储藏180 d后均有检出，且在15 ℃和20 ℃下的检出量有显著性差异；平板培养法在15 ℃和20 ℃下的检出量与原始样品之间无显著性差异，在25 ℃及以上温度检出结果与原始样品之间有显著性差异。与平板培养法和电镜赋值法相比较，真菌孢子计数法在霉菌生长量较少的情况下即可检出，且在检出量较少的情况下能区分不同处理之间的差异性，因此，能更早地发现霉菌的生长。从不同温度下储藏180 d 稻谷样品的检出情况来看，三种方法的灵敏度排序为孢子计数法>电镜赋值法>平板培养法。

表1 不同温度下储藏180 d的稻谷样品检出情况的多重比较

扫描电子显微镜是一种大型精密仪器，广泛用于观察固体物质表面的超微结构，所拍摄图像的放大倍数和分辨率高，真实、清晰、并富有立体感。粮食行业标准中的真菌孢子计数法因操作简单、快速，灵敏度高，成本低，已作为一种粮食霉变早期检测方法在各大粮库中使用。平板菌落培养计数法作为传统的微生物检测方法，广泛应用于粮食储藏期间不同霉菌种类的研究。对三种检测方法的操作过程、仪器设备要求，以及在本实验中的检测结果进行比较，结果见表2。

表2 三种检测方法比较

扫描电子显微镜观察赋值法在实验前需要做喷金处理，一批次可观察的粮粒数量有限。因观察视野放大倍数较大，单个样品单面全范围扫描观察耗时较长。扫描观察过程中还发现，霉菌菌丝和孢子在粮粒表面分布不均匀，不同视野内分布密度有差异，在同一批次粮粒间生长分布差异较大，造成检测结果重复性较差。此外，扫描电镜属大型精密仪器，设备的规范性操作要求高，设备本身的购买和维护费用很高，单个样本的检测成本偏高。因此，扫描电子显微镜更适用于粮食表面附着霉菌结构的精细观察，针对不同区域分布密度的赋值累加比较的分析方法还有待进一步优化。

孢子计数法分为孢子洗脱和孢子计数两部分[8]，操作简单，在孢子识别计数过程中需要具备一定的微生物学基础，粮食储藏从业人员有一定的霉菌基础知识，稍加培训即可独立操作。收集粮食样品后，在3～5 min内便能得到检测结果。检测所需的设备主要是生物显微镜，仪器成本低，单个样品检测成本不到1元，在粮食储备库检化验室普及的可能性高。因此，孢子计数法更适用于储粮霉变的早期检测，但该方法主要对洗脱出的所有霉菌孢子进行检测，无法判断洗脱出的霉菌孢子是否有活性，检测结果偏高。

平板培养法的操作步骤主要有孢子洗脱和孢子培养，检测过程需要提供无菌环境，对检测人员的专业技能及实验条件要求较高，粮食行业操作难度较大[27-29]。平板培养法将样品表面洗脱的有活性的霉菌培养成菌落，可对感染的真菌进行初步鉴定。但由于培养条件与实际仓储环境和以粮食为营养基质的环境有较大差别，不能真实反映储粮环境中正常生长霉菌的类群，检测结果偏低，且培养时间至少在5～7 d，检测结果存在一定的滞后性，检测时效性较差[30]。

综上所述，本研究所使用的三种检测技术各有优缺点，在应用中需根据实际需求进行选择，多种方法相结合可更准确地反映储粮中霉菌的生长情况。

3 结论

综合上述三种方法的检测结果可知，含水量为14.6%的稻谷在15 ℃低温条件下储藏，可有效地抑制霉菌生长，20 ℃条件下虽有少量霉菌生长，但不会造成较大的危害，而在25 ℃及以上长期储藏，存在较大的风险。霉菌的生长与稻谷的水分密切相关，当稻谷含水量降至14.0%以下，霉菌生长基本趋于停滞。控制储藏温度和稻谷水分可有效降低霉菌的污染程度。

稻壳对稻谷具有天然保护作用。同一储藏条件下，储藏霉菌在稻谷表面的检出时间早于糙米表面；同一储藏时间，稻谷表面的检出量大于糙米表面，相差1个数量级左右。稻谷加工过程中经脱壳处理可显著降低糙米的带菌量。

扫描电镜观察赋值法、真菌孢子计数和平板菌落培养计数法三种方法在本研究中的霉菌检出情况基本一致。三种方法各有优缺点，相比较而言，真菌孢子计数法在霉菌生长量较少的情况下可检出，且在检出量较少的情况下能区分不同处理之间的差异性，能更早、更快地发现霉菌的生长，从而为粮食的安全储藏提供预警信息。