三阴乳腺癌中EGFR及VEGFR的表达及与病理特征的相关性分析

戴 翔 李 冰 云洪岩 张 雄 陈凤兰 裴德恩

广东省佛山市禅城区中心医院病理科，广东佛山 528031

乳腺癌是临床常见的一类女性恶性肿瘤，具有高度异质性，三阴性乳腺癌（triple-negative breast cancer，TNBC）是指孕激素受体、雌激素受体与人表皮生长因子受体均呈阴性表达的疾病，占所有乳腺癌类型的10%～20%[1-2]。TNBC 多发于绝经前女性，具有强侵袭性、转移性，常用靶向药物、抑制雌孕激素的内分泌治疗均难以起到较好的效果，而全身化疗虽然能起到一定效果，但治疗过程中容易出现复发、转移，因此TNBC 患者预后通常较差，研究其分子生物学特征对于其治疗方案的选择、预后的改善具有重要意义[3-5]。本研究回顾性分析TNBC 患者的临床病理资料，分析表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）、血管内皮生长因子受体（vascular endothelial growth factor receptor，VEGFR）的表达情况，并分析其与TNBC 临床病理特征的关系，有助于评估TNBC 患者的病情及预后情况。

1 资料与方法

1.1 一般资料

回顾性选取2018年3月—2020年3月在佛山市禅城区中心医院行手术治疗的200 例乳腺癌患者作为研究对象，所有患者均已经孕激素受体、雌激素受体与人表皮生长因子受体检查，其中TNBC 患者100例，非TNBC 患者100 例，患者均为女性。纳入标准：①均经手术治疗并经病理确诊为乳腺癌[6]；②术前均未进行放化疗及免疫治疗；③均留存有手术切除肿瘤组织的石蜡标本；④临床病理资料完整。排除标准：①合并其他部位原发肿瘤者；②患有心、肝、肾等重要器质性疾病者。本研究已经医院医学伦理委员会审核批准。TNBC 组中，年龄32～78 岁，平均（58.04±19.95）岁；病程3～5年，平均（3.26±1.12）年。非TNBC 组中，年龄31～75 岁，平均（57.75±16.34）岁；病程3～5年，平均（2.94±1.36）年。两组患者的一般资料比较，差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。

1.2 研究方法

收集所有患者的临床病理资料，包括年龄（＜50岁和≥50 岁）、绝经状况（是否绝经）、肿物直径（≤2 cm和＞2 cm）、临床分期（Ⅰ～Ⅱ期和Ⅲ～Ⅵ期）、病理分型（浸润性导管癌和非浸润性导管癌）、组织学分级（Ⅰ～Ⅱ级和Ⅲ级）、淋巴结转移情况（有无淋巴结转移）等，收集术后病理组织检测EGFR 与VEGFR 表达情况，分析其表达差异及其与TNBC 临床病理特征之间的关系。

1.3 检测方法

采用免疫组化法检测EGFR 与VEGFR 在TNBC患者中的表达，试剂盒购自丹麦Dako 公司，按照试剂盒说明书操作。免疫组化法步骤：①对所有患者乳腺癌组织分别进行标示、编号；②将乳腺癌组织蜡样块进行连续切片处理，切片厚度4 μm；③应用二甲苯浸泡3 次进行脱蜡处理，浸泡完毕后，再分别用95%、85%和65%的酒精冲洗二甲苯；④应用高压锅缓慢加热加压，修复组织抗原，冷却后，应用PBS 溶液冲洗3 次，每次3 min；⑤应用3%过氧化氢溶液灭活内源性过氧化物酶并洗脱后，再于切片上加入B7-H6分子兔抗人单克隆抗体，洗脱，进行DAB 染色；⑥蒸馏水洗脱后，应用苏木素进行复染；⑦无水酒精脱水，晾干后封片处理，镜检。EGFR 以细胞膜出现棕黄色颗粒为阳性，VEGFR 以细胞膜与细胞质出现棕黄色颗粒为阳性，每张切片由两名高年资病理科医生采用双盲法观察，按阳性细胞占比划分蛋白表达强度，0%～10%为“-”，11%～25%为“+”，26%～50%为“++”，＞50%为“+++”[7]。

1.4 统计学方法

采用SPSS 21.0 统计学软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（±s）表示；计数资料采用率（%）表示，组间比较采用χ2检验；采用Spearman秩相关检验进行关系分析。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 TNBC 患者的临床病理情况

年龄：＜50 岁69 例（69.00%），≥50 岁31 例（31.00%）；绝经状况：是38 例（38.00%），否62 例（62.00%）；肿物直径：≤2 cm 37 例（37.00%），＞2 cm 63 例（63.00%）；临床分期：Ⅰ～Ⅱ期58 例（58.00%），Ⅲ～Ⅵ期42 例（42.00%）；病理分型：浸润性导管癌71 例（71.00%），非浸润性导管癌29 例（29.00%）；组织学分级：Ⅰ～Ⅱ级43 例（43.00%），Ⅲ级57 例（57.00%）；淋巴结转移情况：有64 例（64.00%），无36 例（36.00%）。

2.2 TNBC 组与非TNBC 组患者EGFR 及VEGFR的表达情况

TNBC 组患者EGFR、VEGFR 阳性表达率均高于非TNBC 组，差异有统计学意义（P＜0.05）（表1）。TNBC患者中，EGFR 免疫组化染色结果中发现EGFR 阳性细胞的细胞膜出现棕黄色颗粒（图1，封四），VEGFR阳性细胞以细胞膜与细胞质出现棕黄色颗粒。

表1 TNBC 组与非TNBC 组患者EGFR 及VEGFR 阳性表达率的比较[n（%）]

图1 TNBC患者中EGFR免疫组化染色结果（100×）

2.3 TNBC 患者EGFR 及VEGFR 表达与临床病理特征的关系

TNBC 患者EGFR 的表达与淋巴结转移相关（P＜0.05），与年龄、绝经状况、肿物直径、临床分期、病理分型、组织学分级无关（P＞0.05）；VEGFR 的表达与临床分期、组织学分级及淋巴结转移均相关（P＜0.05），与年龄、绝经状况、肿物直径、病理分型无关（P＞0.05）（表2）。

表2 TNBC 患者EGFR 及VEGFR 表达与临床病理特征的关系[n（%）]

2.4 TNBC 患者EGFR 与VEGFR 表达的关系

Spearman相关性分析显示：TNBC 患者EGFR与VEGFR 的表达之间存在正相关关系（r=0.306，P＜0.05）。

3 讨论

近年来关于TNBC 的分子治疗靶点成为了研究热点。EGFR、VEGFR 均为近年被广泛研究的肿瘤相关调控分子。EGFR 是EGFR 家族的成员之一，广泛分布在上皮细胞、成纤维细胞等细胞表面，可以激活下游的信号传导通路，促进细胞增殖分化与肿瘤形成[8]。VEGFR 是一种典型的跨膜蛋白，可诱导内皮细胞增殖与迁移，调控血管、淋巴管内皮细胞的新生，对于胚胎发育、肿瘤细胞增殖迁移起着重要调节作用[9]。多项研究提示，EGFR、VEGFR 在TNBC 进展中也发挥了一定作用[10-11]。

本研究分别对100 例TNBC 与100 例非TNBC患者进行EGFR 与VEGFR 蛋白表达检测，结果显示，TNBC 较非TNBC 患者表现出EGFR 与VEGFR 的高表达。既往研究[12-13]表明，TNBC 癌细胞过表达EGFR，为51.0%～53.7%，而非TNBC 中EGFR 表达为10%～31%。本研究中TNBC 患者EGFR 阳性表达率为52.00%，而非TNBC 患者为21.00%，与上述研究的表达趋势基本一致。有研究指出，VEGFR 在TNBC 中的表达率为80%，而在非TNBC 患者中为51%[7]。而本研究中TNBC 患者VEGFR 阳性表达率为71.00%，非TNBC 中VEGFR 阳性率表达为56.00%，基本与该研究报道接近。

本研究进一步分析TNBC 患者EGFR 与VEGFR表达与临床病理特征的关系，结果显示，TNBC 患者EGFR 的表达与淋巴结转移相关，而VEGFR 的表达与临床分期、组织学分级及淋巴结转移均相关（P＜0.05）。既往研究表明，EGFR 在癌症进展中发挥促进血管生成、促进癌细胞转移、增强癌细胞黏附功能与抑制凋亡等作用[14]。其在淋巴结转移患者中呈现更高表达，表明其与癌细胞的迁移存在密切联系。居红格等[15]的研究通过比较TNBC 和非TNBC 各30 例患者的临床病理资料，发现EGFR 与淋巴结转移、远处转移存在显著的相关性。胡波等[16]采用免疫组化检测了57 例浸润性导管腺癌患者中相关分子表达，发现EGFR 在TNBC 患者中表达明显上调，与这类型肿瘤的高侵袭性一致。VEGFR 广泛表达于早期胚胎血管内皮细胞上，但在胚胎发育后期与正常成体中仅特异性地在淋巴管内皮细胞上表达，此外也少量表达于正常乳腺组织的毛细血管、内分泌器官中，在同其配体VEGF-C 与VEGF-D 特异性结合后，能促进癌细胞的淋巴管迁移[17-18]。本研究结果还显示，TNBC 患者EGFR与VEGFR 的表达之间存在正相关关系（P＜0.05），表明其表达具有协同性，共同在TNBC 的进展中发挥调控作用。EGFR 在TNBC 中的报道较多，而目前VEGFR 的相关报道多见于肺腺癌中，在乳腺癌中仍较少见[19-20]。

综上所述，TNBC 患者EGFR 及VEGFR 存在高表达，且其表达与病理特征之间存在相关，对于评价TNBC 的病情及预后有一定的意义。由于本研究时间较短，未对乳腺癌患者进行随访，因此EGFR、VEGFR的表达与预后的关系还未探讨，日后将可能在临床实验中增加随访内容进行深入探讨。