新疆地区FGB基因多态性对纤维蛋白原水平及胆囊结石发病的影响

阿丽叶古丽·艾皮热， 皮尔地瓦斯·麦麦提玉素甫， 王 俭， 艾克拜尔·艾力,，克力木·阿不都热依木,

新疆维吾尔自治区人民医院 a.普外微创研究所， b.微创、疝和腹壁外科， 乌鲁木齐 830001

纤维蛋白原(fibrinogen, Fg)是纤维蛋白的前体，即凝血因子I，是一种不对称的大分子量蛋白质，是血浆中含量最高的凝血因子，主要是作为凝血因子 I 直接参与凝血过程。血浆Fg水平升高是血栓性疾病、心脑血管病的重要危险因素，也参与胆囊胆固醇结石的形成[1-4]。

Fg是一种急性期反应产物，由Aα、Bβ和γ三对对称排列的多肽链组成，其生物合成受遗传和环境等多种因素的影响，其中基因多态性是导致个体间血浆Fg水平差异的重要遗传因素，而纤维蛋白原β链(FGB)基因多态性是造成其水平差异的重要因素之一[5-7]。虽然，多项研究报道了Fg基因多态与其水平关联，但无文献报道该基因多态和胆囊结石的关联。故笔者在前期研究中，以基因多态性研究为出发点，对胆囊结石患者FGB基因的变异进行了系统的筛查，筛查出了17个多态性位点。而在本研究中，根据筛查结果，并结合参考文献[8-10]报道，选择rs4220、rs1044291两个多态性位点进行基因型分析结合单体型分析，明确 FGB 基因rs4220、rs1044291位点多态性对Fg水平的影响及与新疆维吾尔族、汉族人群胆囊结石的关系。

1 资料与方法

1.1 研究对象 收集2017年12月—2020年5月在本院住院的胆囊结石患者150例，去掉信息不全1例和测序失败1例，入组148例。对照组为同期在本院体检的非胆囊结石者150例，去掉临床信息不全1例，入组149例。所有受试对象均采集性别、年龄、身高、体质量、BMI、空腹血脂、总胆固醇(TC)、甘油三脂(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)等临床资料。

1.2 主要设备与试剂 实时荧光定量PCR仪(CFX96 bio-rad，美国)，ND5000(Thermo，美国)，3730XL基因测序仪(Applied Biosystems Inc.，美国)，普通PCR仪(ABI 9700)，Taq酶(Fermentas，加拿大)，Taq DNA ligase(NEB，美国)，qPCR PreMix(Probe)(天根，FP208)，dNTP(Fermentas，加拿大)，ExoI酶(Fermentas，加拿大)，FastAP酶(Fermentas，加拿大)，Snapshot试剂盒(ABI，美国)。

1.3 方法

1.3.1 血浆Fg水平测定 采用全自动血凝分析仪AMAX200(磁珠法)测定血浆Fg水平。由本院医学检验中心统一测定。

1.3.2 单核苷酸多态性分型 标本采集：清晨空腹采集3 ml肘静脉血于含EDTA的抗凝管中，置于-80 ℃保存。基因组DNA提取：采用酚/氯仿法提取外周血DNA，-20 ℃保存。基因分型：采用SNaPshot技术进行SNP分型。位点引物由上海吉真生物科技有限公司合成，各位点PCR引物及单碱基延伸引物见表1。

表1 PCR引物及单碱基延伸引物序列

1.4 伦理学审查 本试验方案经新疆维吾尔自治区人民医院伦理委员会审核批准，批号： 2017D01C096。

2 结果

2.1 一般资料 在维吾尔族人群中，HDL-C在胆囊结石组和对照组之间有显著差异(P<0.05)，而年龄、收缩压、舒张压、BMI、游离脂肪酸、TC、TG、LDL-C、Fg在胆囊结石组和对照组之间差异均无统计学意义(P值均>0.05)。在汉族人群中，舒张压、游离脂肪酸、Fg水平在胆囊结石组和对照组之间差异均有统计学意义(P值均<0.05)，而年龄、收缩压、BMI、TC、TG、LDL-C、HDL-C间差异均无统计学意义(P值均>0.05)(表2)。

表2 研究对象的一般特征

2.2 FGB基因多态位点基因型分布与胆囊结石的关系

2.2.1 Hardy-Weinberg检验 经Hardy-Weinberg遗传平衡检验发现FGB基因rs4220、rs1044291多态性位点基因观察值和期望值相吻合。胆囊结石组、对照组P值均>0.05，表明研究对象的选择无遗传学偏差，该群体是遗传平衡群体，具有一定的可靠性及代表性(表3)。

表3 胆囊结石组FGB基因rs4220、rs1044291位点分布频率Hardy-Weinberg平衡检验

2.2.2 FGB基因多态位点基因型和等位基因频率分布

在胆囊结石及对照组中FGB多态位点基因型和等位基因频率的单变量分析表明，在维吾尔族、汉族研究人群中rs4220、rs1044291位点基因型的分布及频率在胆囊结石组和对照组间均无显著差异(P值均>0.05)(表4)。

表4 FGB基因rs4220、rs1044291位点基因型分布

2.3 FGB基因rs4220、rs1044291位点多态性与血浆Fg水平 因上述FGB基因rs4220、rs1044291多态性位点的TT或AA基因型检出率过低，故将CT、TT或AG、AA基因型合并为一组来分析。结果显示，在汉族人群中，胆囊结石组与对照组间比较， rs4220位点的GG基因型者血浆Fg水平高于对照组(Z= -3.04，P<0.05)， rs1044291位点T基因携带者较对照组血浆Fg水平增高，差异有统计学意义(t=2.8，P<0.05)。 在维吾尔族人群中，胆囊结石组与对照组间比较，只有rs4220位点的A基因携带者血浆Fg水平高于对照组，差异有统计学意义(Z=-2.41，P<0.05)。两个民族胆囊结石组、对照组内各基因型Fg水平比较差异均无统计学意义(P值均>0.05)(表5)。

表5 胆囊结石组与对照组中各基因型与血浆Fg水平的关系

2.4 影响胆囊结石病危险因素分析 本研究采用多因素二分类logistic回归评估Fg定量、族别、高血压、BMI、游离脂肪酸、年龄等自变量对研究对象患胆囊结石的影响。结果显示族别与Fg是胆囊结石的危险因素，Fg每增加一个单位，患胆囊结石的风险增加5.3%(P=0.042)；维吾尔族相较于汉族，患胆囊结石的风险增加 80.4%(P=0.014)(表6)。

表6 影响胆囊结石的危险因素分析

3 讨论

在西方国家，胆囊结石病发病率为5.9%～21.9%[11]，在我国胆囊结石的发病率为 4.2%～11.0%[12]。新疆为我国胆囊结石高发区，其患病率为15%，其中南疆患病率 (17.5%)高于北疆 (13.5%)[13]。胆石症已逐渐成为影响新疆各民族健康的主要问题之一。胆囊结石的成因非常复杂，是一种与遗传、内分泌功能紊乱、代谢、营养及环境因素等相关的多因性疾病。根据化学成分分类，胆结石可以分为胆固醇性胆结石、胆色素性胆结石和混合性胆结石[14]。庄建华等[15]对新疆维吾尔族和汉族的胆结石类型进行研究，发现维吾尔族、汉族胆结石类型存在差异：维吾尔族胆结石以单纯胆结石多见，且以胆固醇型结石为主，而汉族主要为肝胆管结石，主要成分为胆色素结石。

文献[3]报道，胆囊胆固醇结石患者胆囊中的Fg水平、抗凝血酶Ⅲ抗原高于非胆石患者，而抗凝血酶Ⅲ活性低于非胆石患者；纤溶酶原水平低于非胆石患者，纤溶酶活性高于非胆石患者，提示纤维蛋白可能受凝血和纤溶因子的影响而在胆囊结石的形成中发挥着作用。本研究结果显示，在汉族人群中，胆囊结石组Fg水平高于对照组，与上述结果一致，但在维吾尔族人群中，Fg水平在胆囊结石组与对照组间无差异，表明Fg水平增高可能与汉族胆囊结石的发生相关。经多因素logistic回归分析也发现，民族与Fg水平是胆囊结石的危险因素。

已有较多研究显示FGB-455G/A多态性与血浆Fg水平相关。Canseco-Avila等[16]对墨西哥西南部118例冠心病伴血栓形成患者进行的研究显示，FGB-455G/A、-148C/T多态性与血浆高Fg水平具有相关性。李军廷等[2]研究显示，腔隙性脑梗死组和对照组AA+AG基因型受试者血浆Fg水平均显著高于GG基因型受试者，考虑FGB-455G/A位点A等位基因可能独立或与其他因素协同作用提高血浆Fg水平。但Cronjé等[17]对南非黑种人进行的一项横断面研究并未发现FGB-455G/A多态性与总体Fg水平之间存在相关性。本研究结果显示，在汉族人群中，胆囊结石组与对照组间比较，胆囊结石组中rs4220位点GG基因型者血浆Fg水平均高于对照组， rs1044291位点T基因携带者较对照组血浆Fg水平增高，差异均有统计学意义。在维吾尔族人群中，胆囊结石组rs4220位点的A基因携带者血浆Fg水平均低于对照组，差异有统计学意义。但两个民族胆囊结石组、对照组内各基因型者Fg水平均无差异。这表明影响维、汉两民族胆囊结石患者血浆Fg水平的FGB基因多态位点基因型不同。提示该多态性对血浆Fg水平的影响可能与地区及种族有关。

国内外对 FGB基因多态性的研究多集中在与脑梗死、冠心病、高血压及慢性阻塞性肺疾病的研究上，但未有文献报道该基因多态性与胆囊结石的相关性，故笔者对新疆维吾尔族、汉族人群FGB基因的变异进行了系统的筛查，筛查出17个多态位点，并结合参考文献报道，选择对rs4220、rs1044291两个多态位点进行基因型分析发现在维吾尔族、汉族中rs4220、rs1044291两个多态位点基因型的分布及频率在胆囊结石组与对照组间无差异。该结果表明FGB基因rs4220、rs1044291位点多态性可能通过调控Fg水平参与新疆人群胆囊结石的发病。

利益冲突声明：本研究不存在研究者、伦理委员会成员、受试者监护人以及与公开研究成果有关的利益冲突。

作者贡献声明：阿丽叶古丽·艾皮热、克力木·阿不都热依木负责课题设计，资料分析，撰写论文；皮尔地瓦斯·麦麦提玉素甫、王俭、艾克拜尔·艾力参与收集全血标本及临床数据；阿丽叶古丽·艾皮热负责拟定写作思路，指导撰写文章并最后定稿。