哌嗪高效降解菌PIPA-6的分离筛选及降解特性

过俊俊,姚雯清,楼丽丽,雷兴华,张 昕

哌嗪高效降解菌PIPA-6的分离筛选及降解特性

过俊俊,姚雯清,楼丽丽,雷兴华,张 昕*

(浙江农林大学林业与生物技术学院,浙江 杭州 311300)

从制药厂周边土壤分离获得一株哌嗪高效降解菌株PIPA-6,其能在以哌嗪为唯一能量来源的无机培养基中生长,30h对100mg/L的哌嗪降解率达100%.形态学观察、生理生化鉴定和16S rDNA基因序列同源性分析表明,菌株为嗜烟碱类节杆菌().菌株PIPA-6具有广泛的温度(10～40℃)和pH(5～10)适应范围、优良的钠盐耐受性(50g/L)和极强的哌嗪抗性(300mg/L),其最佳降解条件为温度35 ℃,pH, 8.体系中额外添加有机碳能提高菌株的降解效率.降解效应的模拟试验结果表明,菌株PIPA-6能在50L模拟罐中稳定发挥降解作用,制药废水中化学需氧量 (COD)和铵态氮含量显著降低(< 0.05),哌嗪降解率在30d达98%.宏基因组测序证实该菌株能在水体中稳定定殖,改变了污水中的微生物群落结构.本研究中所获菌株充实了哌嗪降解菌种资源库,实验结果为菌株的实际开发应用提供了初步理论依据.

哌嗪；降解；嗜烟碱类节杆菌；降解特性

哌嗪是一种无色透明针状或叶状结晶的有机杂环胺,其作为生产喹喏酮类抗菌药物的重要中间体[1-4],具有一定的杀菌、杀虫和除草活性[5-6],同时也大量被应用于橡胶合成、阻燃剂生产以及精细化工[7-8].由于其巨大的市场潜力,哌嗪生产厂商大量涌现.据不完全统计,目前中国哌嗪产能已经在每年5000t以上,在全球占比约1/7[9].然而哌嗪制品生产后并不能完全回收,其残留的部分会随废水排放.含哌嗪及其衍生物的废水属于高氮低碳型有机胺废水,通常高盐、高碱,因不利于微生物生长而难以被生物降解,一旦流入环境易造成残留[10],哌嗪作为一种含氮杂环化合物常在环境中被高频次检出[11].毒理学研究表明,哌嗪的长期低剂量摄入会对人类的神经和肝脏产生毒副作用,如致幻、兴奋和精神抑制[12-14];长期暴露在含有哌嗪的环境中还有致癌的风险,严重危害人类健康[15].因此采用有效手段严格控制富含哌嗪污水的排放、从源头控制哌嗪的污染扩散,是保障生态环境和生命安全的关键所在.

目前,富含哌嗪污水的理化处理主要采用化学氧化和催化氧化工艺,其缺点是成本高,且具有二次污染的风险[16].利用微生物的降解作用去除污水中残留有毒有机污染物因其效率高、效果好、操作简便以及价格低廉一直是污水处理的有效手段[17].然而利用微生物降解环境中残留的哌嗪却一直面临菌种资源难以获得且实际应用效果不佳的问题.曾有学者分离获得30个菌株,能在脱氮情况下降解哌嗪的衍生物吡咯烷和哌啶,却没有一株能够降解哌嗪[18].有研究分离获得一株能以哌嗪为唯一碳源和氮源进行生长的细菌spTOH,降解效率较高,但其实际应用却受到温度的限制.当温度低于20℃时,哌嗪的降解能力大幅下降[19].因此,急需从环境中筛选环境适应性好、抗逆性强、降解性能稳定的降解菌株用于哌嗪废水的处理,以达到净化水体的目的.

本研究从制药厂周边土壤中分离获得适应性好、能以哌嗪为唯一能源的高效降解菌株,明确菌株的最佳降解条件并进入模拟测试,验证了菌株的实际应用效果.实验结果对于充实哌嗪降解微生物菌种资源,丰富哌嗪污水处理的理论和实践体系都具有重要意义.

1 材料与方法

1.1 培养基与主要试剂

NKKM培养基(g/L):NaCl 1.0,KH2PO40.5, K2HPO41.5,MgSO4˙7H2O 0.2(pH 7.0),含无水哌嗪100mg/L,用于哌嗪降解菌株的富集、筛选和降解特性研究.LB培养基(g/L):胰蛋白胨10,酵母提取物5,NaCl 10(pH 7.0),用于菌株形态观察和生理生化指标测定.对甲基苯磺酰氯储备液用于哌嗪衍生和含量检测.菌株的分子鉴定及污水中全菌体DNA提取所需试剂盒均购自上海生工生物工程有限公司.

1.2 实验方法

1.2.1 哌嗪降解菌的富集与筛选 采集浙江上虞某制药厂周边污水流经地面以下10～15cm处土壤.称取5g新鲜土样加入100mL NKKM培养基中, 30℃、160r/min摇床震荡培养,3d后每天从富集培养基中取悬液1mL,采用稀释平板法于固体富集培养基上分离菌株.选择长势良好且传代稳定的菌株纯化后用于后续实验.

1.2.2 菌株的降解效果测定 菌株的培养在三角瓶中进行.在200mL哌嗪终浓度为100mg/L的NKKM培养基中接种10%(/)新鲜培养至OD600为1.8的降解菌菌悬液.接种后将三角瓶置于30℃, 160r/min条件下生长,每6h取样菌液测定哌嗪的含量.哌嗪含量的检测采用高效液相色谱法(HPLC).具体方法为:取5mL待测液体置于试管,加入100μL 0.1mol/L NaOH溶液、1mL对甲基苯磺酰氯储备液,加盖试管塞后放入50℃水浴锅中反应10min,取出冷却后加入5mL二氯甲烷,充分震荡萃取后取有机相进行液相色谱检测.液相色谱检测条件:XB-C18柱(4.6mm×200mm,5μm);流动相为甲醇:水(60:40);流速0.8mL/min;进样量:20μL;室温;检测波长: 240nm.鉴于预实验发现哌嗪极难降解,30d内其自降率£5%.本实验中不另外设置未添加菌株的哌嗪溶液作为对照.菌株对哌嗪的降解率以初始哌嗪浓度的降低为据计算,计算公式如下:

降解率(%)=(0-C)/0´100%

式中:0为哌嗪初始浓度;C为哌嗪降解时间的浓度.

1.2.3 菌株的鉴定 采用电镜进行菌体的形态学观察;菌株的生理生化测定参照东秀珠方法进行[20];菌株的16S rDNA测序分析参照周赓方法进行[21].测序所得序列在NCBI上进行blast比对,利用MEGA-7软件采用最大相似法构建系统发育树.

1.2.4 菌株的生长特性 按照1%(v/v)接种量将菌株接种至LB培养基中,30℃、160r/min摇床震荡培养,定期取菌液测定OD600,绘制菌株的生长曲线,明确菌株的对数生长期,确定后续取样时间.以同样接种、培养和取样方法测定降解菌株在不同温度(10～40℃)、初始pH值(pH 5～11)、氯化钠浓度(0～50g/L)、通气量(0～2L/min)和添加不同碳源、氮源情况下的生长情况.本实验所有处理设置3个平行,碳源和氮源测试中以无额外添加的LB培养基培养体系为参比对照(CK).

1.2.5 菌株降解的环境适应范围 按照1.2.4方法测定在不同温度、初始pH值、碳源、氮源、金属离子(1mmol/L)情况下,菌株PIPA-6对哌嗪的降解适应范围,每个处理设置3个平行.

1.2.6 菌株降解效应的模拟试验 模拟活性污泥法废水处理技术,在50L大罐中利用菌株PIPA-6对哌嗪的降解效应以及水净化能力进行中试试验.取制药厂新鲜废水,先用纯净水做2倍稀释(改善其高盐和高碱的特性),然后将降解菌株按10%(/)接入废水中,室温下(25℃～30℃)30d时间内连续观察罐中活性污泥和水质的颜色、形态变化,定期取水样对水质的COD以及哌嗪含量等指标按国标进行测定.

1.2.7 污水水体中微生物群落结构分析 收集1.2.6试验中处理30d后的水样(CS),采用试剂盒法提取全菌体DNA,委托北京诺禾致源科技股份有限公司对菌株的16S rDNA V4区进行扩增子测序分析[22].试验以初始废水(YS)为参比,分别设置3个平行,比较废水经菌株处理前后的微生物群落结构变化.

1.3 数据的处理

实验所得数据均利用SPSS 16.0 软件进行方差分析,在0.05水平(<0.05)确认差异显著性.

2 结果与讨论

2.1 菌株的分离筛选和鉴定

富集培养基在10d后明显变浑浊,吸取悬液经多次稀释分离和平板划线后,最终筛选出一株能在以哌嗪为唯一碳源和氮源的固体富集培养基上稳定生长的菌株,命名为PIPA-6.

菌株PIPA-6在LB固体培养基上培养48h后形成圆形、表面微隆起、有光泽、挑起略有粘连的灰白色菌落.电镜观察发现菌株PIPA-6细胞呈不规则短杆状,存在球杆变化,不形成芽孢,如图1-(a).染色试验及生理生化测定结果表明:菌株为革兰氏阳性细菌;菌株抗酸性染色、氧化酶试验、VP试验、甲基红试验均呈阴性,接触酶试验阳性;能还原硝酸盐;能水解酪素、明胶和淀粉;能利用葡萄糖、蔗糖和蛋白胨.菌株的16S rDNA测序结果表明菌株PIPA-6与s的相似性最高,达到100%,在进化树上聚为一枝(图1-(b)),表明二者亲缘关系最近.综合以上表型,所获菌株最终被鉴定为.起初吸引眼球是因为其对尼古丁优良的降解作用,很多学者围绕该菌株展开了一系列相关研究[23-24],然而对哌嗪的降解作用本文报道尚属首例.属细菌具有强大的代谢酶体系,能分解环境中多种有毒有机物残留,如农药扑海因[25]、阿特拉津[26]、异丙胺[27],抗生素磺胺甲嘧啶[28-29]以及致癌物多环芳烃[30]等.鉴于其多元降解活性,该属细菌在未来的环境污染修复中具有广阔的挖掘和利用空间.

图1 降解菌PIPA-6的形态与系统发育树

2.2 菌株PIPA-6的生长特性

2.2.1 菌株的生长曲线与降解能力 在LB培养基中接种6h后,菌株PIPA-6开始进入对数生长期,细胞数目迅速增加,至24h时达到峰值并随即缓慢减少.降解菌株的细胞生长与菌株对哌嗪的降解能力呈现出明显的正相关性.随着时间的推移,当体系中细胞数量大量增加后,哌嗪的残留明显减少,降解率也显著提高.24h内菌株对100mg/L的哌嗪降解率达到84.64%,30h 时哌嗪降解率已达100%(图2).综合考虑菌体的生长速度和悬液中的细菌含量,在后续的实验中选择培养24h作为时间节点取样和测定各项实验指标.

图2 菌株PIPA-6的生长曲线和降解能力

2.2.2 各种理化因子对菌株生长的影响 环境中的理化因子是影响菌株生长的重要因素.实验结果表明,菌株PIPA-6能耐一定的酸度,在pH 5～10范围内均可生长.菌株对碱性环境有良好的适应性, pH值在7～9之间时,菌体生长量显著高于其他处理,最适生长pH值为8(图3(a)).降解菌对NaCl具有极强的耐受性,在供试的0～50g/L浓度范围内均有明显生长能力,生长最佳浓度为30g/L(图3(b)).菌株拥有优良的耐盐性,能有助于其在高盐废水中发挥作用.菌株PIPA-6有广谱的温度适应范围,在10～40℃均能生长,最适生长温度为30℃(图3(c)).菌株几乎不能利用无机碳源(碳酸氢钠、碳酸氢钾)和氮源(硝酸钾、氯化铵),但是在体系中添加有机碳源,如葡萄糖和蔗糖,氮源,如蛋白胨则能大大促进降解菌PIPA-6的细胞生长(图3(d),3(e)).菌株的良好生长需要氧气的参与.在通气量在0.2～1L/min范围时,通气量和菌株生长呈现正相关,但差异并不显著.当通气量过高时(2L/min),导致其生长受到轻微抑制,而静置培养则因为溶液中溶氧量有限,导致菌体细胞生长不良(图3(f)).

2.3 菌株降解的环境适应范围

温度是影响菌株降解哌嗪的重要环境因素,在本实验中菌株PIPA-6能在较宽的温度范围(15～40℃)内发挥降解作用,最高降解率出现在35℃,略高于利于细胞增殖的30℃.其主要原因可能是降解酶的最适温度高于菌株生长的最适温度.目前一些已有的降解菌株之所以未能成功应用的一个原因之一就是低温时降解活力差,本研究获得的菌株在20℃时,24h对100mg/L的哌嗪降解率达到72.31%,15℃仍能发挥降解作用(图4(a)).相较于其他已发现降解菌株,PIPA-6具有更好的温度适应性,有更广泛的温度工作范围.

菌株在初始pH值在7～9时均有较好的哌嗪去除率,在过酸(pH£6)或过碱(pH³11)条件下,降解作用受到明显抑制(图4(b)),这可能与菌株在上述情况下长势较差有关.菌株能够耐受高浓度的哌嗪,在300mg/L的浓度下仍然显示出较强的降解能力.在接种菌株PIPA-6 48h后,哌嗪的残留已难以检出(图4(c)).但值得注意的是,哌嗪浓度越高,需要降解的时间也越长.在降解体系中添加氯化铵与硝酸钾不能促进菌株对哌嗪的降解(图4(d)),推测其原因可能是哌嗪本身即为有机杂环胺,能为降解菌生长提供氮源,而其他含氮化合物的存在则会形成竞争抑制.相反,在体系中添加葡萄糖和蔗糖均能促进哌嗪的降解(图4(e)),其原因可能是增加的碳源改善了原本体系中的营养状态,优化了碳氮比.此外,有毒害作用的重金属离子的存在会影响菌株的降解性能,如Co2+和Cd2+(图4(f)).

2.4 菌株降解效应的模拟试验

图5 废水中COD、哌嗪和氨氮含量变化

活性污泥是废水净化的核心要件.利用50L大罐制成废水净化模拟装置.模拟实验的连续观察表明,外源添加降解菌对体系中的活性污泥无不良影响.在30d时间范围内活性污泥外观形态正常,体积有扩大趋势.供试废水经连续处理后水体颜色由棕黄色变淡且有澄清迹象,水质大大改善,水体中COD、哌嗪以及氨氮含量均显著降低(<0.05)(图5).其中COD由最初的38375mg/L降为1050mg/L,氨氮含量从148.21mg/L减少为41mg/L,而哌嗪则由最初的32.1mg/L降至0.7mg/L,降解率达98%.模拟实验证实降解菌PIPA-6能发挥哌嗪降解作用,降解效果显著.

2.5 污水水体中微生物群落结构分析

对测序污水样品的OTUs聚类,并对OTUs的代表序列进行物种注释及丰度分析发现,污水处理前和处理后水中占绝对优势的细菌都属于变形菌门(Proteobacteria),这与已报道的污水活性污泥中微生物的种类分布规律一致[31-32].然而接种菌株PIPA-6改变了微生物的群落结构,原先水体中占绝对优势的g-变形菌纲细菌被a-变形菌纲细菌所取代(图6(a)).同时,30d后水体中出现了大量放线菌纲细菌(Actinobacteria),与未处理的污水相比差异显著(<0.05)(图6(b)).基于本文中分离获得的菌株PIPA-6隶属于放线菌门放线菌纲,本研究中污水体系放线菌纲细菌丰度的显著增加可能为降解菌株在污水处理体系中的成功定殖所致,这为后续发挥降解作用提供了物质基础.

a) 纲水平上的物种相对丰度; b) 处理与对照组间纲水平上差异显著(<0.05)的物种(Actinobacteria)分析,条形表示组间丰度差异显著的物种在每组中的均值(means);c)细菌种群间互作图谱,节点代表微生物类群,点间连线表示物种间有互作关系;d)处理与对照组代谢差异分析;YS:未加菌原始水样;CS:接菌30d后水样

对水体中各菌群的互作分析发现,污水降解体系中变形菌纲(Proteobacteria)与放线菌纲(Actinobacteria)、拟杆菌纲(Bacteroidetes)、厚壁菌纲(Firmicute)和酸杆菌纲(Acidobacteria)细菌之间存在复杂的网络关系(图6(c)),这暗示着这些菌群之间存在复杂的互作,而哌嗪等水体中其他化合物的分解可能是多个菌群协同代谢的结果.由于外源添加降解菌改变了污水中的微生物群落结构,这使得处理水与原始污水的代谢途径也不尽相同.从图6(d)可以看出尽管在2种水体中都进行着相当规模的化能异养代谢(Chemoheterotrophy),但有菌株添加的水体还进行高比例的硝酸盐还原(Nitrate reduction)和脱氮反应(Denitrification).而未处理的水体中则更多的进行铁呼吸(iron respiration)、厌氧发酵(fermentation)、碳氢化合物的降解(hydrocarbon degradation)以及原生动物的寄生和共生等.由此推测,废水中高浓度的氨氮以及哌嗪的分解与微生物介导的硝酸盐还原(Nitrate reduction)和脱氮反应密切相关.

3 结论

3.1 筛选获得能以哌嗪为唯一碳源和氮源的高效哌嗪降解菌PIPA-6. 菌株PIPA-6有广泛的温度(10～40℃)和pH(5～10)适应范围、优良的钠盐耐受性(50g/L)和极强的哌嗪抗性(300mg/L),尤其具有耐低温(15℃)、高盐(50g/L NaCl)、高碱(pH 10)的独特降解优势.

3.2 将菌株PIPA-6引入废水处理模拟装置后,制药废水的化学需氧量 (COD)和水体中铵态氮含量显著降低,哌嗪降解率在30d时间内达98%,证实菌株能稳定发挥降解哌嗪、净化水体的实际作用,具有良好的开发应用潜力.菌株PIPA-6能够在水体中定殖,其对哌嗪的去除和污水净化的一个原因可能与菌株优化水体中微生物群落结构、改变其代谢途径有关.

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感谢杭州秀川科技生物有限公司在模拟罐装置设计和污水参数测定过程中给予的建议和指导.

Isolation and screening of piperazine degrading bacterium PIPA-6 and its degradation characteristics.

GUO Jun-jun, YAO Wen-qin, LOU Li-li, LEI Xin-hua, ZHANG Xin*

(College of Forestry and Biotechnology, Zhejiang A & F University, Hangzhou 311300, China)., 2021,41(9)：4360～4366

Piperazine-degrading strain PIPA-6was isolated from the soil around a pharmaceutical plant in this study, the strain could grow in medium with piperazine as the sole energy source, and the degradation rate for 100mg/L of piperazine reached 100% within 30h. Strain PIPA-6 was finally identified asbased on the analysis of morphological observation, physiological and biochemical tests, as well as 16s rDNA sequencing. Strain PIPA-6 could grow in a wide range of temperatures (10～40℃) and pH (5～10), with excellent sodium salt tolerance (50g/L) and high piperazine resistance (300mg/L). The optimum degradation was achieved at 35℃, pH,8. The degradation efficiency of the strain could be significantly improved by adding organic carbons.Simulation experiments showed that strain PIPA-6played a vital role in piperazine degradation in 50L simulation tank, the parameter of chemical oxygen demand(COD) and the content of ammonium nitrogen in pharmaceutical wastewater were significantly reduced(< 0.05).Degradation rate of strain PIPA-6 for piperazine was up to 98% in 30d. Metagenomics analysis confirmed that the strain could successfully colonize in the wastewater and shape new microbial community structure compared with the initial one. The strain obtained in this study enriched the resource of the piperazine-degrading strains, and the experimental results provided a preliminary theoretical basis for the development and practical application of the strain.

piperazine；degradation；；degradation characteristics

X172,X703.5

A

1000-6923(2021)09-4360-07

过俊俊(1999-),男,安徽毫州人,本科生,主要从事环境微生物研究.发表论文1篇.

2021-02-01

国家自然科学基金资助项目(31970093;31670110)

* 责任作者, 副教授, zhangxins@126.com