大麻素受体在子宫腺肌病在位内膜中的表达*

汪 沙 段 华 沈 雪

(首都医科大学附属北京妇产医院妇科微创中心，北京 100006)

子宫腺肌病是指具有生物活性的子宫内膜腺体和间质侵入子宫肌层所致的局灶性或弥漫性病变[1]，是妇科常见的难治性疾病，主要表现为痛经、月经异常和不孕。子宫腺肌病的病因机制尚不明确，虽然基底内膜腺体内陷学说指出子宫内膜基底层可能因妊娠或外力机械等因素受损，为子宫内膜进入肌层生长提供条件，但是在位内膜侵入肌层并生长的方式目前还不甚清楚[2]。

内源性大麻素系统(endocannabinoid system，ECS)由一系列内源性生物活性脂质(也称为内源性大麻素)、特异性内源性大麻素受体和负责内源性大麻素合成、转运和降解的酶组成[3,4]。大麻素受体是存在于细胞膜或细胞质内的可与内源性大麻素结合促其在体内发挥生物学作用的一类特殊蛋白质，现公认的主要包括1型大麻素受体(cannabinoid receptor 1，CB1)和2型大麻素受体(cannabinoid receptor 2，CB2)两种类型，均属于非特异性G蛋白耦联受体家族[4]。

已有研究报道ECS参与子宫内膜异位症细胞增殖凋亡的调节、细胞侵袭和迁移、免疫炎性状态、病灶神经支配和疼痛的感知等[5,6]。此外，还被证实可影响多种肿瘤的血管生成过程和纤维化疾病的纤维化进程[7,8]。然而，关于ECS在子宫腺肌病发生发展中的作用鲜有报道。为此，本研究初步通过检测ECS的主要成分CB1和CB2受体在子宫腺肌病患者在位内膜中的表达情况，并与正常子宫内膜组织中大麻素受体的表达水平进行对比，以探讨大麻素受体对腺肌病发生的潜在作用。

1 材料与方法

1.1 临床资料

本研究经我院医学伦理委员会批准(2016-KY-012-01)，患者信息采集及标本收集均于术前获得患者充分知情同意并签署知情同意书。

选择2017年7月～2018年12月45例因弥漫型子宫腺肌病于我院妇科微创中心行全子宫切除术的子宫内膜标本为腺肌病组，组织病理诊断弥漫型子宫腺肌病，无子宫内膜病变；同期34例因宫颈疾病(宫颈上皮内瘤变Ⅲ级16例，宫颈癌ⅠA期18例)切除子宫的子宫内膜标本作为对照，组织病理诊断宫颈疾病，无子宫腺肌病，无子宫内膜病变。2组均排除盆腔炎、生殖系统发育异常等疾病，排除合并内分泌、免疫代谢性疾病，排除术前3个月内曾使用性激素类药物治疗或宫内节育器。

子宫腺肌病组45例，对照组34例。2组年龄分别为(46.0±3.8)岁(37～53岁)和(44.2±5.0)岁(32～53岁)(t=1.820，P=0.078)。子宫腺肌病组中子宫内膜处于增殖期23例，分泌期22例，对照组增殖期22例，分泌期12例(χ2=1.460，P=0.227)。2组子宫体积分别为(255.5±205.3)mm3和(83.9±44.2)mm3(t=7.922，P=0.000)。

1.2 方法

1.2.1 组织取材 2组子宫切除后立即由专人进行组织取材，于无菌条件下自子宫前壁“Y”形剖开，两侧直达宫角，留取宫腔在位内膜1.0 cm×1.0 cm×0.5 cm，用生理盐水冲洗去掉血液后分为两份，一份置于10%中性福尔马林溶液中24小时用于制备石蜡切片，另一份置入液氮中迅速转移至-80 ℃冰箱保存用于提取RNA。

1.2.2 免疫组化二步法染色检测CB1和CB2蛋白表达 组织标本常规固定脱水、石蜡包埋，连续4 μm切片制片。切片于60 ℃烤片2 h，二甲苯及梯度乙醇常规脱蜡，乙二胺四乙酸(EDTA)高压修复抗原，3%H2O2去离子水阻断内源性过氧化物酶，3%山羊血清封闭，轻轻甩掉封闭液，在切片上滴加磷酸缓冲盐溶液(PBS)按一定比例配好的一抗(CB1稀释比例1∶300；CB2稀释比例1∶100)，4 ℃孵育过夜。滴加即用型免疫组化试剂盒中的多聚酶结合物和放大剂，室温孵育，二氨基联苯胺(DAB)避光显色，镜下观察染色情况；苏木素复染，常规脱水、透明、中性树胶封片。阴性对照以磷酸盐缓冲液代替一抗进行孵育。由2位观察者对染色结果进行盲式阅片，苏木素染细胞核为蓝色，DAB显出的阳性表达为棕黄色。通过Image pro plus 6.0图像分析软件对免疫组化结果进行分析，在400倍视野下检测内膜组织阳性染色部位的平均光密度值(mean optical density，MOD)进行定量分析。

1.2.3 实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测CB1和CB2 mRNA表达 应用RNA提取试剂盒(日本Takara公司)提取细胞总RNA，以10 μl体系反转录合成cDNA，并进行PCR反应扩增。CB1和CB2及内参照磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)基因序列通过Gene Bank获得。引物设计和合成由上海生工生物科技有限公司完成，引物序列见表1。qRT-PCR反应采用7500 Real Time PCR仪(美国ABI公司)，扩增反应采用三复孔。PCR扩增参数：95 ℃、10 min，1个循环；94 ℃、30 s，55 ℃、60 s，72 ℃、30 s，共40个循环。生成定量标准曲线图，计算机软件分析循环阈值(Ct值)，通过2-ΔCt相对定量法[9]，计算目的基因mRNA的相对表达量，ΔCt=Ct(目的基因)-Ct(内参基因)。每个样品重复3次，取3次平均值。

表1 qRT-PCR技术检测CB1和CB2的引物序列

2 结果

2.1 子宫内膜中CB1和CB2蛋白的分布

不论是腺肌病组还是对照组，CB1蛋白除了子宫内膜腺上皮细胞外，还表达于间质细胞，但在子宫内膜腺上皮的表达强于间质。分布主要在细胞浆，呈棕黄色颗粒(图1)。与CB1蛋白类似，CB2蛋白亦广泛表达于2组子宫内膜组织中，以子宫内膜腺上皮的表达为最强，主要分布在细胞浆，呈棕黄色颗粒(图2)。

图1 CB1蛋白的免疫组化染色：A、B分别为增殖期和分泌期的腺肌病组在位内膜，C、D分别为增殖期和分泌期的对照组正常内膜，棕黄色颗粒为阳性染色(×400，标尺5 μm) 图2CB2蛋白的免疫组化染色：A、B分别为增殖期和分泌期的腺肌病组在位内膜，C、D分别为增殖期和分泌期的对照组正常内膜，棕黄色颗粒为阳性染色(×400，标尺5 μm)

2.2 2组CB1和CB2蛋白表达的比较

2组CB1、CB2蛋白表达的比较见表2。CB1蛋白在腺肌病组增殖期、分泌期在位内膜中表达量(MOD值)均低于对照组；腺肌病组CB1蛋白在增殖期与分泌期的表达差异无统计学意义，而对照组增殖期低于分泌期。CB2蛋白在腺肌病组增殖期、分泌期在位内膜中表达量均低于对照组；2组CB2蛋白的表达增殖期均低于分泌期。

表2 2组CB1蛋白、CB2蛋白表达量(MOD值)的比较

2.3 2组CB1和CB2 mRNA表达的比较

2组CB1、CB2 mRNA相对表达水平的比较见表3。CB1 mRNA在腺肌病组增殖期、分泌期在位内膜中的表达量均低于对照组；腺肌病组CB1 mRNA在增殖期与分泌期的表达差异无统计学意义，而在对照组中增殖期低于分泌期。CB2 mRNA在腺肌病组增殖期、分泌期在位内膜中的表达量均低于对照组；2组CB2 mRNA的表达增殖期均低于分泌期。

表3 2组CB1、CB2 mRNA相对表达水平的比较

3 讨论

3.1 CB1和CB2与腺肌病发生发展的关系

目前有关ECS在子宫腺肌病中的研究有限。本研究结果显示，与正常子宫内膜相比，不论是增殖期还是分泌期，大麻素受体CB1和CB2在子宫腺肌病患者的在位内膜中的表达均下降，提示ECS可能参与腺肌病的发生发展。Resuehr等[10]的研究也显示CB1的表达在对照组的分泌期最高，不论在增殖期还是分泌期，CB1的表达在子宫内膜异位症的内膜组织中最低。

有关ECS在生殖领域中的研究表明，ECS可能受性激素的影响[11,12]。Di Blasio等[13]通过文献综述了影响大麻素活性的脂肪酸酰胺水解酶(FAAH)、N酰基磷脂酰乙醇胺-磷脂酶D(NAPE-PLD)以及大麻素受体CB1和CB2在女性生殖系统中的表达水平都随着性激素而变化。这些报道与我们观察到的正常内膜中CB1和CB2的表达呈月经周期性差异一致。ECS的这种周期性改变对正常生育功能的维持至关重要[14]。

3.2 CB1和CB2参与腺肌病发生发展的过程和临床意义

子宫腺肌病通常被认为是一种雌激素依赖性疾病，主要病理特征为炎性、纤维化、神经血管生成和子宫收缩异常[15]。多项研究证实大麻素受体在炎症调节中起着重要作用[16,17]。Iuvone等[18]的研究显示，大麻素受体存在于炎性子宫内膜组织中，且CB2的选择性活化与子宫内膜炎症中的一氧化氮释放过程有关。ECS和免疫系统之间的相互作用可能会影响胚胎植入过程中有关生物进程的调节[19,20]。ECS可通过调节细胞因子、趋化功能和增殖能力参与多种免疫细胞系的调节，而这些免疫细胞对于维持正常的妊娠非常重要[21]。基于上述证据和我们观察到的结果，我们推测在子宫腺肌病的子宫内膜组织中CB1和CB2的表达降低可能与免疫炎性状态改变及腺肌病相关性不孕有关。

此外，动物研究已经证实CB1和CB2的上调可以选择性地抑制子宫肌层的自发性收缩，如果在人的子宫中存在类似的机制，那么子宫腺肌病患者中存在的异常子宫收缩亦可以通过激活这2种受体来缓解[22]。至于前面提到的子宫腺肌病的其他病理特征，亦有研究证实针对大麻素受体CB1或CB2的靶向治疗，可以在多种纤维化疾病中发挥抗纤维化的作用[23]。大麻素受体也被证实参与肿瘤的血管生成和侵袭进程[7]。此外，有研究显示CB1受体在子宫内膜异位症的动物模型中可以促进子宫内膜异位症神经支配和异位病灶的生长[24]。

本研究中我们还观察到大麻素受体CB1和CB2在子宫腺肌病的表达并不完全一致，CB2在腺肌病组和对照组都存在孕激素依赖性，表达量在分泌期高于增殖期，而CB1的表达在子宫腺肌病的内膜组织中失去月经周期性改变。这一点与Resuehr等[10]的报道一致，他们认为内膜CB1的表达呈孕激素依赖性，而在子宫内膜异位症病人中该月经周期性差异被打断。通过与CB2的对比，我们所观察到的子宫腺肌病内膜中CB1丧失了月经周期性改变可能表明它在腺肌病的发病机制中比CB2发挥着更为重要的作用。本研究为进一步明确子宫腺肌病的病理机制提供理论依据，同时也为延缓子宫腺肌病发生发展提供潜在治疗靶点。

本研究也存在一些局限性：首先，这只是一项初步的观察性研究，尚需更多功能性研究来验证CB1在子宫腺肌病发病机制中的作用；其次，样本量的不足可能会掩盖一些潜在的差异。因此，更大样本量的功能性研究有助于进一步阐明这一问题。