谷子秸秆微晶纤维素的制备与表征

栗晶晶，王浩川，付莎莉，常智，荆小院，李毅，肖畅，朱子卿，薛智权，郭宁馨，高建华*

（1.山西农业大学 生命科学学院，山西 太谷030801；2.山西农业大学 农学院，山西太谷030801）

随着化石资源的日益枯竭，寻找可代替的再生资源已成为全世界的研究热点。作为化学能源的替代物，生物质资源的研究和利用受到人们的广泛关注。纤维素是生物界最丰富的有机物质之一，应用领域广泛。改型纤维素用途更广泛，例如微晶纤维素（Microcrystalline cellulose，MCC）是直径在20～80μm的纤维素颗粒，具有无毒、机械强度高、重量轻、可降解、可再生等特性［1，2］，常被用作保水剂、药用赋形剂、悬浮稳定剂、药片粘结剂和填料、聚合物复合材料的增强剂等［3～5］，广泛应用于食品、化妆品、医疗和制药等领域［6］。

为了提高生物质利用率，近年来人们尝试从多种材料中制备MCC，比如茶叶废料［2］、棉条［7］、油棕空果串［8］、稻草［9］、黄麻［10］、废纸［11］和阿尔法纤维［12］等。MCC常用碱处理和酸水解等化学方法来制备［9］。在此过程中，碱液对纤维素的溶胀作用去除了木质素和部分半纤维素［13］；稀酸处理导致半纤维素进一步去除［9］，强酸处理后糖苷键断裂，无定形区水解［14］，并在一定程度上降低MCC链间聚合度使MCC的结晶度达到55%～80%［6，15］。但是制备过程中，传统加热方法耗时长且效率不高，因此，人们还尝试了多种辅助工艺，比如超声波、微波、物理挤压［16，17］、生物酶解［18］、水热解［19］等进一步提高处理效率。研究表明，与传统加热方法相比，将微波处理应用于微晶纤维素的制备可以缩短反应时间、提高反应效率，从而节省能源［9］。但是，从不同原料中获得的MCC在结晶度、含水量、表面积、孔隙度和分子量等性质上略有不同［11］。

谷子（Setaria italica）是我国传统作物。虽然谷子种植面积无法与玉米、水稻等大宗作物相比，但是每年种植面积1.3×106hm2的生物量也相当可观［20］。近年来研究人员用谷子秸秆来生产沼气［21］、动物饲料［22］和燃料［23］等。目前，用谷子秸秆制备MCC的研究较少。本文以谷子秸秆为原料，采用微波辅助的酸碱处理法制备谷子秸秆微晶纤维 素（Foxtail millet straw microcrystalline cellulose，FMS-MCC），并对其进行表征，为谷子秸秆利用开拓新的方向。

1 材料与方法

1.1 材料和菌株

小黄谷秸秆（2019年5月初种植于山西省晋中市太谷区，收获于2019年11月）。

解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens，Ba）SXAU-01株型，由山西农业大学生命科学学院薛智权老师课题组自主筛选并鉴定。

1.2 FMS-MCC制备试剂

FMS-MCC制备所用试剂：甲苯、乙醇、氢氧化钾、双氧水、次氯酸钠、冰醋酸、盐酸（所用试剂均为分析纯）。

培养基配置：微量元素混合溶液（1L）：H3BO357 mg，MnSO4·7H2O 43 mg，ZnSO4·7H2O 43 mg，CuSO4·5H2O 40 mg，Na2MoO4·2H2O 37 mg，Co（NO3）2·6H2O 25 mg；无机盐基础培养基（1L）：NH4Cl 1.1 g，K2HPO41.0 g，NaCl 0.5 g，KCl 0.2 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，FeSO40.001 g，CaCl20.01 g，Yeast Extract 0.2 g，微 量 元素 混 合 液1 mL，FMS-MCC 10 g，pH=7；LB液体培养基（1L）：Tryptone 10.0 g，Yeast Extract 5.0 g，NaCl 10.0 g，自然p H。

1.3 试验方法

1.3.1 纤维素的分离

（1）脱色。用打粉机将谷子秸秆打碎，过100目筛。称取40 g粉末，50～60℃温水洗涤，过滤去除可溶性杂质与部分色素。洗涤3次后，将滤渣放入60℃烘箱中干燥。干粉用甲苯-乙醇混合物（2∶1，v/v）进行索氏提取，除去蜡和色素后干燥处理。

（2）碱处理。向上述粉末中加入4%的氢氧化钾（w/v）和2%的双氧水（w/v），料液比为1∶35（w/v）［9，24］。微波辅助加热30次（每次1 min），温度低于80℃。待冷却至室温后，加7%（v/v）的次氯酸钠，混匀后放置过夜。不溶部分用蒸馏水洗涤至中性后，50℃烘干。

1.3.2 微晶纤维素的制备

微晶纤维素制备流程如图1所示。

图1 微晶纤维素制备流程图Fig.1 Process chart of MCC

1.3.3 微晶纤维素的表征

（1）粒径测量。将FMS-MCC过200目标准筛，振荡2 min［25］，分别称量截留和过筛粉末的质量，根据公式（1）计算过筛率：

（2）产率测定。盐酸处理前的粉末精确称重，记录为m1；FMS-MCC精确称重，记录为m2，根据公式（2）计算产率1：

谷子秸秆粉末（Foxtail millet straw powder，FMSP）准确称重，记录为M 0；FM 1～FM 5分别精确称重，记录为M，根据公式（3）计算产率2：

（3）体视显微镜观察。用体式显微镜（OLYMPUS SZX16）对FM 1～FM 5以 及 商 品MCC拍照，进行产品表观结构比较。

（4）扫描电镜（Scanning electron microscope，SEM）分析。用MC1000离子喷镀仪分别为FMSMCC和商品MCC等样品镀钯，然后，用扫描电镜（HITACHISU 8010）观察样品微观表面形态。

（5）傅立叶变换红外光谱（Fourier Transform infrared spectroscopy，FT-IR）分析。分别将FMSMCC和商品MCC等干燥样品与光谱级溴化钾粉末混合，研磨并压制成片，用傅立叶红外光谱仪（Bruker Tensor 27）检测样品化学结构。

1.3.4 生物降解试验

选择一株具有较高纤维素降解活性的解淀粉芽孢杆菌（Ba SXAU-01株型），以本文FMSMCC制备流程中各个阶段产品作为碳源，进行细菌培养。通过细菌的生长情况判断其对不同阶段产品中纤维素的利用效率。

挑取Ba SXAU-01菌株的单克隆，接入LB液体培养基中，28℃，180 r·min-1振荡培养过夜。将培养好的菌种按照1∶100分别加入到含有FMSMCC（FM 1～FM 5）、甲苯处理后样品、碱处理后样品以及商品MCC（含量均为0.01 g·mL-1）的无机盐培养基中。28℃，180 r·min-1振荡培养，分别于0、18、26、31、43、54和79 h测定细菌培养液的光密度值（OD600），判定细菌生长情况。

2 结果与分析

2.1 MCC制备

2.1.1 木质素和部分半纤维素的去除

本研究利用氢氧化钾和双氧水去除谷子秸秆木质素和部分半纤维素，处理前后粉末质量变化见表1。该结果表明小黄谷秸秆中纤维素等多糖总量和木质素等含量接近。

表1 碱处理前后质量变化Table 1 Biomass changes before and after alkali treatment

2.1.2 酸处理梯度试验结果

对碱处理后样品进行酸解，以切割纤维素大分子。本研究用微波辅助加热处理不同时间（10、20、30、40和50 min）检测纤维素切割效果。结果显示，酸处理前后，5个处理时间的不溶物质质量损失均小于15%（产率1），并且随着酸处理时间延长，质量损失逐渐增加。另外，5个酸处理产物的过筛率（200目）均在55%以上（表2）。进一步计算发现，从FMSP到FMS-MCC的产率（产率2）达到30%～40%。

表2 酸处理梯度试验结果Table 2 Results of acid treatment at different times

2.2 体视显微观察

从直观角度可看出，5个梯度产品（FM 1、FM 2、FM 3、FM 4、FM 5）无 明 显 区别；且 与商 品MCC外形相似。但FMS-MCC均质地疏松；而商品MCC颗粒更细致、匀称，质地更紧密（图2）。

图2 FMS-MCC和MCC体视显微观察结果Fig.2 Stereoscopic microscopic observation of FMS-MCC and MCC

2.3 扫描电镜观察

扫描电镜观察结果发现，FMSP主要呈片层结构，表面光滑平整，其上附着一些不规则的结构（图3A）。碱处理后的样品与FMSP相比，原始结构明显受到破坏，呈不规则形态，表面粗糙（图3B）。FMS-MCC（FM 4）表面粗糙呈短棒或颗粒状，与碱处理后样品相比长度更短，但直径变大，且有聚合现象，与商品MCC形态类似（图3C和D）。

图3 各阶段样品的扫描电镜图Fig.3 Scanning electron micrographs of samples at different stages

FM 1～FM 5总体相似程度极高，但随着盐酸处理时间的增加，产品表面逐渐平整。FMSMCC与商品MCC之间无明显差异，只在纤维素表面上略有不同，商品MCC更光滑平整（图4）。

图4 FMS-MCC和MCC扫描电镜图Fig.4 Scanning electron micrographs of FMS-MCC and MCC

2.4 傅立叶变换红外光谱分析

为了进一步确定纤维素提取和纯化效果，对样品的化学结构和官能团进行了红外光谱分析。结果显示，未进行化学处理的FMSP中，存在半纤维素和木质素关键基团的特征峰，例如，1734 cm-1处的峰值是半纤维素或木质素脂肪族酯的特征峰［9］；1515 cm-1是木质素中芳香骨架C=C震动的吸收峰［9，12］（图5A）。碱处理后样品中1515 cm-1处的曲线趋于光滑，表明木质素完全去除，而FMS-MCC的光谱中，1734 cm-1和1515 cm-1处的曲线都趋近于光滑［9］，说明酸碱处理后，木质素和半纤维素完全去除。所有样品在3400～3500 cm-1间都显示出很强的吸收峰，这是由纤维素的-OH伸缩振动导致的［26］。其他纤维素特征峰还包括：C-H对称伸缩振动的吸收峰（2899 cm-1）［26～29］、纤维素结合水的吸收峰（1640 cm-1）［1，30］、纤 维素C-H键弯曲振动的吸收峰（1376 cm-1）［30］、β-1，4糖苷键的C-O-C的伸缩振动（1164 cm-1）、纤维素中C-O-C吡喃环骨架的伸缩振动（1059 cm-1）［30］、纤维素中葡萄糖环的β-糖苷键是C-H摇摆振动峰（896 cm-1）［1］等。对酸处理不同时间获得的FMSMCC分析表明，其峰型基本一致，说明这些样品的结构本质是相同的（图5B）。

图5 不同样品的傅立叶红外图谱Fig.5 Fourier infrared spectrum of different samples

2.5 生物降解试验分析

由图6可见，FMSP和甲苯处理后样品对Ba SXAU-01的生长速度影响与商品MCC之间差异显著（P＜0.05），而FM 5和商品MCC之间无明显差异（P＞0.05）。其中，在FMSP中生长最快，甲苯处理后样品次之，FM 5比碱处理后样品略慢，在商品MCC中最慢（图6A）。不同碳源下，该菌均在54 h附近到达平台期。使用FM 1～FM 5的FMS-MCC进行细菌培养，发现接菌后20 h左右，不同碳源间细菌生长速度基本一致，此阶段与商品MCC无较大差异；在26～43 h菌体大量繁殖，OD600值有差异；43～54 h，菌体生长速度减慢，OD600值有显著差异；54 h以后，菌液浓度趋于稳定，OD600值无差异。FM 1～FM 5与商品MCC之间也无明显差异（P＞0.05），但随着时间的推移，FMS-MCC表现出更好的生长促进作用，生物量略高于商品MCC（图6B）。

图6 细菌对FMS-MCC利用效果检测Fig.6 The effect of FMS-MCC on Ba SXAU-01 strain

3 讨论

本研究利用传统的碱处理、酸水解法从谷子秸秆中制备微晶纤维素（FMS-MCC），在制备流程的关键环节加入微波辅助，以缩短处理时间，提高处理效率。研究表明，利用谷子秸秆获得微晶纤维素，产率达30%～40%。产率随着酸处理时间的延长缓慢降低，可能是由于酸处理导致更多的糖苷键被破坏，产生更多的可溶性糖所致。该结果符合预期。但是，不同处理时长对FMSMCC质量损失影响较小，可能是由于酸处理使用的盐酸浓度相对较低（12%，w/v）且反应温度60℃时纤维素分解速度较为缓慢［31］。本研究仅使用一种谷子农家种秸秆制备MCC，不同谷子品种间的产率可能存在差异。

FMSP的化学组成，比如木质素、半纤维素、纤维素等未遭破坏，电镜下呈现片层结构［32］。碱处理后的样品呈现出不规则形态，推测碱处理可能破坏了FMSP中的非纤维素化合物（主要是木质素、部分半纤维素等），同时木质素和多糖分子之间的交联状态也随之破坏，导致纤维素充分暴露［33］。碱处理降低了材料的聚合度和结晶度［32］。傅立叶光谱分析结果也揭示了木质素、半纤维素特征峰的变化［9］，进一步确定了木质素的彻底去除。强酸处理去除非晶态区域的纤维素纤维［9，32］，并将纤维尺寸减小到微晶级别。对碱处理后各个阶段的产品比较发现，纤维素各个特征峰不再发生显著变化，说明样品成分已趋于稳定。

相比张冬丽等［34］使用传统加热法制备的玉米秸秆微晶纤维素，微波辅助加热法制备的FMSMCC产率更高，可能是微波加热加快了β-1，4糖苷键断裂的效率［9］。直接观察发现，商品MCC的颗粒更细致，本文制备的FMS-MCC更为松散，可能由于未对FMS-MCC进行球磨，而该步骤通常是工业化生产MCC时的后期关键步骤［35］。

微生物培养实验结果显示FMSP更有利于Ba SXAU-01的生长，可能是由于FMSP包含秸秆所有组分，营养物质种类更丰富，有利于细菌的生长。而Ba SXAU-01在含有碱处理后的样品、FMS-MCC或商品MCC的无机盐培养基中的生长速度显著低于FMSP。该结果也能说明，相应处理已将FMSP中非纤维素物质去除。值得注意的是，随时间变化，FMS-MCC和商品MCC之间无显著差异，但FMS-MCC的OD600值略高，即该解淀粉芽孢杆菌在FMS-MCC中生长速度更快。推测这种差异的原因是本文制备的FMS-MCC比商品MCC疏松，有利于微生物的降解。这一现象仍需进一步的研究确定。综合电镜观察结果，笔者认为在有微波辅助的盐酸处理下，10 min已经能够获得较理想的FMS-MCC。

4 结论

传统酸碱处理加以微波辅助从谷子秸秆制备微晶纤维素（FMS-MCC）。体式显微镜、傅立叶红外和电镜观察以及微生物培养综合显示，碱处理能够很好的去除木质素，FMS-MCC与商品MCC相比并无较大差异。FMS-MCC可以同商品MCC一样，应用于化妆品、医疗和制药等领域。随着谷子推广面积的不断增大，可观的秸秆、谷壳生物量也应受到关注。这为谷子秸秆和农业秸秆的综合利用拓宽了新方向。