循环肿瘤细胞对直肠癌术前放化疗患者疗效及预后的评估价值

韦斌,钟晓刚, 麦威,黄顺荣,牙韩清,王晓通

直肠癌是临床常见病，其发病机制复杂，是多种因素作用的结果，包括免疫因素、遗传因素、生活习惯、饮食习惯等[1-3]。全球患病率均较高，每年新发病例超过140万，以东欧、亚洲国家居多[4]。近年来，我国直肠癌初筛检出率达19.47%，直肠癌根治术及术后放疗、化疗在该病治疗中应用广泛，但术后转移、复发率仍较高，导致病死率高[5]。研究表明，术前新辅助放疗、化疗能够促进瘤体缩小，改善局部水肿，减轻炎性反应，提升手术疗效[6]。然而，部分患者对新辅助干预不敏感，导致疗效、预后欠佳，现阶段主要通过影像学检查、肿瘤标志物等对治疗效果进行评估，当发现转移灶、瘤体复发时，病情扭转难度大[7-8]，因此，临床还需寻求更理想的方式预测疗效与预后。有学者发现，循环肿瘤细胞(circulating tumor cells，CTC)可通过肿瘤原发灶、转移病灶脱落，释放入血并参与血液循环，与直肠癌预后密切相关，经CTC检测甚至可发现影像学无法发现的早期微转移[9]。基于此，本研究分析CTC对直肠癌术前放疗、化疗患者疗效、预后的评估价值，进一步了解CTC判断直肠癌患者病情改善与进展的可行性，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2016年9月—2019年6月广西壮族自治区人民医院胃肠疝肠瘘外科收治直肠癌患者136例，患者术前均行新辅助放疗、化疗，其中男78例，女58例，年龄38～73(58.63±11.98)岁；病程3～12(8.32±3.09)个月；直肠癌诱因：高脂肪、低纤维膳食67例，肥胖62例，其他7例；合并基础疾病：糖尿病27例，高血压32例；家族遗传史21例；吸烟史39例；饮酒史31例；肿瘤直径2～8(5.43±2.15)cm；临床分期：Ⅰ期34例，Ⅱ期66例，Ⅲ期36例；分化程度：低分化32例，中/高分化104例；肿瘤形态：溃疡型82例，浸润型33例，隆起型16例，其他5例。本研究经医院伦理委员会批准(审批号：2015GXZZRMYY)，患者及家属均知情同意并签署知情同意书。

1.2 选择标准 (1) 纳入标准：①术后经病理诊断证实为直肠癌者[10]；②病理分期为Ⅰ～Ⅲ期，行根治手术治疗，术前进行新辅助放疗、化疗者；③初诊患者；④精神状态正常，沟通良好者。(2)排除标准：①同时患有其他部位的原发性肿瘤者；②因直肠癌复发入院就诊者；③出现远处转移者；④患全身炎性疾病者；⑤患血液系统疾病、自身免疫性疾病者；⑥长期使用抗凝药物者；⑦心、肺等脏器严重受损者。

1.3 治疗方法 所有患者术前行新辅助放疗、化疗。(1)放疗：患者仰卧位，充盈膀胱，经3DCRT技术实施放疗，针对病灶原发部位、局部淋巴引流区、高危复发区域进行治疗，总剂量为45.0～50.4 Gy，每次剂量为1.8～2.0 Gy，共计26～28次。(2)化疗：采用Folfox6方案行同步化疗，奥沙利铂(浙江海正药业股份有限公司)85 mg/m2静脉滴注，第1天；四氢叶酸(赤峰蒙欣药业有限公司)400 mg/m2静脉推注，第1天；氟尿嘧啶(山西普德药业股份有限公司)400 mg/m2静脉滴注，第1天，之后调整为1 200 mg/m2，每日1次，静脉滴注2 d，同步化疗2个周期，辅助化疗2～4个周期。(3)手术方式:均为传统开腹或腹腔镜直肠癌根治术。

1.4 观测指标与方法

1.4.1 临床/病理特征：指导患者完善影像学检查，搜集记录患者临床/病理相关资料，包括性别、年龄、病程、诱因、吸烟史、饮酒史、合并基础疾病、家族遗传史、脉管癌栓、肿瘤直径、临床分期、分化程度、肿瘤形态等。

1.4.2 CTC检测：(1)CTC富集，采集患者治疗前空腹肘静脉血4 ml，在4 h内富集；取PBS液5 ml置于离心管，将富集后的静脉血标本置入，经PBS液清洗2次，取清洗液离心15 min，分离隔膜上层液体，将其置于新的离心管中，经PBS液清洗2次，取清洗液离心10 min，弃上清液，取Fc封闭液40 μl加入，混匀，在4℃条件下反应5 min，另取抗EpCAM抗体包被磁珠40 μl加入，清洗2次，重悬磁珠，将细胞与磁珠充分混合，在4℃下反应2 h；最后启动IsoFlux分选设备，对CTC进行富集。(2)CTC鉴定，取福尔马林液40 μl固定富集后样本，时间为20 min，洗涤弃上清，取10%驴血清40 μl加入，封闭5 min，弃上清，取 1%兔源抗CD45抗体40 μl加入，反应20 min，洗涤弃上清，取0.5%驴抗兔CyTM3共轭抗体40 μl加入，避光条件下反应20 min，弃上清，取0.2%Triton X-100 100 μl加入，透膜5 min，弃上清，取10%抗CK-FITC结合抗体40 μl加入，避光下反应40 min，洗涤，弃上清，染色1 min，弃上清，重悬样本；利用磁铁对重悬后样本进行吸附，风干，经盖玻片盖住，树胶封片，由专业人员鉴定，并进行CTC计数。(3)阳性评价[10]，经光学显微镜分析细胞形态，若细胞直径>12 μm，且主要呈长形或圆形，细胞形态完整，则视为阳性。

1.4.3 预后评估：随访18个月，分析患者的总生存率，分析CTC对患者预后的评估价值。

1.5 新辅助治疗效果评价：待新辅助治疗结束后，评估疗效。评价标准[11]：利用MR、CT等方式观察病灶最大径，将疗效分为以下4个等级：(1)完全缓解，瘤体完全消除；(2)部分缓解，瘤体缩小≥30%，但未达100%；(3)稳定，瘤体缩小不足30%，或增加不足20%；(4)进展，瘤体增长≥20%，或有新病灶形成。总缓解率=(完全缓解+部分缓解)/总例数×100%。

2 结 果

2.1 不同CTC表达直肠癌患者临床/病理特征比较 136例患者中，CTC阳性表达84例(61.8%)为CTC阳性组，阴性表达52例(38.2%)为CTC阴性组。CTC阳性组临床分期Ⅲ期、低分化占比高于CTC阴性组(P<0.05)，但2组性别、年龄、病程、诱因、吸烟史、饮酒史、合并基础疾病、家族遗传史、肿瘤直径、肿瘤形态、脉管癌栓等比较差异均无统计学意义(P>0.05)，见表1。

表1 不同CTC表达2组直肠癌患者临床/病理特征比较 [例(%)]

2.2 2组新辅助治疗疗效比较 CTC阳性组总缓解率为33.33%，低于CTC阴性组的51.92%(P<0.05)，见表2。

表2 2组直肠癌患者新辅助治疗疗效比较 [例(%)]

2.3 2组患者预后比较 患者随访18个月，无失访病例，CTC阳性组总生存率为84.52%(71/84)，低于CTC阴性组的96.15%(50/52)，差异有统计学意义(χ2=4.427，P=0.035)。

2.4 不同疗效及预后患者CTC计数比较 根据患者新辅助治疗疗效分成缓解组(n=55)、未缓解组(n=81)，缓解组CTC计数为(2.82±0.96)个，低于未缓解组的(6.63±2.75)个(t=9.865，P=0.000)。根据患者预后分成生存组(n=121)、死亡组(n=15)，生存组CTC计数为(2.73±0.85)个，低于死亡组的(6.49±2.81)个(t=11.322，P=0.000)。

2.5 CTC计数对患者疗效、预后的评估价值 CTC计数评估患者新辅助治疗疗效的曲线下面积(AUC)为0.764，CTC计数评估患者预后的AUC为0.794，见表3、图1。

表3 CTC计数对直肠癌患者疗效、预后的评估价值

2.6 直肠癌患者预后的COX多因素分析 经COX多因素回归模型对相关变量行量化赋值，临床分期、分化程度、CTC表达情况作为自变量X，以预后作为因变量Y(生存=0，死亡=1)，结果提示，临床分期高、分化程度低及CTC高表达是直肠癌患者预后的影响因素(P<0.05)，见表4。

表4 直肠癌患者预后的COX多因素分析

注：CTC.循环肿瘤细胞

3 讨 论

目前，临床针对直肠癌仍主张采用综合治疗方案，即在无根治性手术治疗禁忌的情况下行手术治疗，并采用放疗、化疗等结合的方式进行干预，改善患者病情[12-14]。即便如此，Ⅰ期、Ⅱ期患者仍约有10%、20% 5年内病情呈现进展趋势，提示在直肠癌患者诊治时可能已出现隐匿性转移，但未能及时发现[15]。研究表明，CTC是肿瘤转移过程中不可或缺的条件，在原发肿瘤初期，肿瘤细胞已参与血液循环，CTC对肿瘤细胞具有播散作用，可促使其到达骨、肝、脑等部位并定植、生长，形成转移病灶，影响预后[16-18]。既往研究提示，CTC在肺癌、乳腺癌等患者的外周血内均有表达，与干细胞特性相似，能够不断增殖、更新，转移功能、侵袭能力强[19-21]。鉴于此，临床可考虑采用CTC对直肠癌患者预后进行评估。

本研究显示，在136例患者中，CTC阳性率高达61.76%，这类患者可能已发生隐匿性转移。通过临床病理特征分析提示，CTC阳性患者的临床分期Ⅲ期、低分化率较阴性患者明显增高，表明直肠癌病情越重，CTC阳性率越高。张筱东等[22]针对胃癌患者进行研究，发现CTC表达与淋巴结转移有关；郭华等[23]以结直肠癌患者为研究对象，发现CTC表达与淋巴结转移、病理分期存在关联，以上研究均佐证了本研究结果。具体原因可能为：CTC主要源于肿瘤病灶组织，其表达情况能反映患者肿瘤负荷程度，是引起肿瘤血行转移的重要原因，临床分期越高、分化程度越低的患者肿瘤负荷越重，可能促使CTC生成增多，致其阳性表达率增高[24-26]。

CTC在原发瘤与转移病灶中均可见表达，经组织基质到达血管，影响肿瘤患者病情[27-30]。本结果提示，CTC阳性表达者的新辅助治疗总缓解率、随访18个月的总生存率均低于阴性表达者，表明直肠癌患者的疗效、预后与CTC表达有关。究其原因，CTC实际上是肿瘤细胞的一种统称，多数肿瘤细胞可通过机体免疫系统吞噬，而少量细胞逃逸，并在其他脏器部位定植，导致癌细胞转移，促使转移病灶形成，影响疗效与预后[31-33]。本研究绘制了ROC曲线，进一步证实CTC计数对直肠癌患者的疗效、预后有较高评估价值。CTC作为肿瘤细胞，可以通过原发灶释放入血，或在摩擦破溃、受到物理挤压后参与血液循环，例如直肠癌患者则可能因粪便摩擦破溃致CTC释放入血，此外，人为手术牵拉也可致其释放入血，导致CTC在外周血中表达增高，促进癌细胞播散，增加复发、转移风险，导致预后欠佳[34-36]。于军辉等[37]也证实CTC对结直肠癌患者预后有预测价值，但其仅针对Ⅱ期患者进行研究，而本研究纳入了Ⅰ～Ⅲ期患者，较其研究更为严谨，参考价值更高。通过分析证实，临床分期、分化程度及CTC表达是直肠癌患者预后的影响因素。CTC主要通过促进肿瘤病灶转移，增加死亡风险[38]。而临床分期越高、分化程度越低的患者治疗难度大，术后复发风险高，也是影响预后的重要因素，临床需引起重视，在直肠癌治疗过程中综合考虑上述多项因素，给予针对性干预。

综上所述，直肠癌患者的CTC阳性率较高，患者新辅助放疗、化疗的疗效及预后与CTC表达密切相关，临床可通过检测CTC表达情况，对患者疗效、预后进行预测。本研究局限性在于仅选取了136例患者进行研究，尤其在分组后各组样本较少，且收集到的临床病理特征条目较少，未来还需增加样本量，进一步完善临床病理资料的收集，更加深入分析直肠癌患者CTC的临床检测价值。

利益冲突：所有作者声明无利益冲突

作者贡献声明

韦斌：设计研究方案，实施研究过程，论文撰写、修改；钟晓刚、麦威：实施研究过程，资料搜集整理；黄顺荣：提出研究思路，分析试验数据，论文审核；牙韩清、王晓通：进行统计学分析