脑脊液细胞因子在帕金森病和非典型帕金森综合征鉴别诊断中的价值☆

夏丹豪 项志 付雨 郑倩艺 王玖琦 滕军放

帕金森病（Parkinson disease，PD）患者存在运动迟缓、肌强直和静止性震颤等症状[1]，非典型帕金森综合征（atypical parkinsonism，AP）包括多系统萎缩（multiple system atrophy,MSA）、进行性核上性麻痹（progressive supranuclear palsy,PSP）等[2]，与PD临床特征相似，尤其在疾病早期，给诊断带来了一定困难。因此，需要特定标志物帮助医生对此类患者进行更及时、准确的诊断。尽管PD和不同AP的病因未知，但脑实质炎症可能参与病程[3]，PD、MSA和PSP患者尸检均发现小胶质细胞激活[4-6]。已在脑脊液（cerebrospinal fluid，CSF）中检测到了由类淋巴系统等通路[7-8]进入的小胶质细胞源性细胞因子[9-10]。本研究评估了PD、MSA、PSP和对照组CSF细胞因子谱差异，并探讨其在疾病鉴别诊断中的价值。

1 对象与方法

1.1 研究对象选取2018年4月到2019年12月我院神经内科收治的34例PD患者、18例MSA患者和23例PSP患者为研究对象，见表1。所有诊断均由两名经验丰富的神经内科主任医师完成，并使用修正Hoehn-Yahr（H-Y）分级量表对患者病情严重程度进行评估。纳入标准：①PD的诊断参考国际帕金森和运动障碍协会（International Parkinson and Movement Disorder Society，MDS）2015年制定的原发性PD诊断标准完成[11]，MSA的诊断参考第二版的统一专家诊断共识及《多系统萎缩诊断标准中国专家共识》完成[12-13]，PSP的诊断参考2015年MDS制定的PSP诊断标准完成[14]；②能完成本研究量表评估及临床指标水平检测。另纳入同时间段来本院体检健康人员29名为对照组，签署知情同意书后于神经内科病房抽取CSF标本。排除标准：①较严重的头颅外伤史和手术史；②伴有严重心血管、肝肾疾病；③精神病史、认知功能障碍者；④由药物或脑血管疾病诱发的帕金森病；⑤老年性、癔症性或紧张性震颤患者；⑥伴有免疫系统疾病；⑦神经系统肿瘤、感染等器质性病变及脑血管疾病者；⑧长期使用非甾体抗炎药物、糖皮质激素类药物治疗。本研究经过医院伦理委员会审核批准，且研究对象均知情同意。

1.2 CSF标本收集通过腰椎穿刺获取研究对象的CSF，立即在 4℃以2000 r/min离心10 min，将上清液等量分装到400 μL无菌聚丙烯试管中，储存在-80℃。从腰椎穿刺开始获取CSF标本到标本冻存的时间控制在60 min以内。

1.3 细胞因子测定采用酶联免疫吸附测定试剂盒 （购自伊莱瑞特或欣博盛生物科技有限公司）并严格按照试剂盒使用说明书检测所有研究对象CSF细胞因子水平，包括C-反应蛋白（C-reactive protein，CRP）、白介素（interleukin，IL）-1β、IL-4、IL-6、IL-10、IL-18、肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α、干扰素（interferon，IFN）-γ 和转化生长因子（transforming growth factor，TGF）-β。每位研究对象的样本重复测3次，结果取平均值。

1.4 统计学方法采用SPSS 25.0、GraphPad Prism 8和MedCalc 19.0进行统计学分析。计量资料若为正态分布以±s表示，若为非正态分布以M（QL,QU）表示。多组间比较采用单因素方差分析或非参数秩和检验，两两比较相应采用LSD-t法或Dunn法。采用受试者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲线分析各细胞因子，ROC曲线下面积（area under the curve，AUC）表示其统计学效能（0.5＜AUC＜0.7为诊断准确性较低；0.7＜AUC＜0.9为诊断准确性尚可；0.9＜AUC为诊断准确性较高）。使用logistic回归模型确定鉴别诊断的最佳细胞因子组合。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 一般资料PD、PSP、MSA组和对照组四组间平均年龄、性别及修正H-Y分级评分比较，无统计学差异（P＞0.05）。见表 1。

表1 各组一般资料对比

2.2 CSF细胞因子水平比较四组研究对象CSF细胞因子水平见表 2。PSP组的 CRP、TNF-α、IL-1β、IL-4和 IL-6水平较 PD组高；MSA组与PD组的各细胞因子水平无统计学差异；与对照组相比，PD组只有IL-4水平显著降低；PSP组的IFN-γ和IL-1β水平显著升高；MSA组所有细胞因子水平无统计学差异。各组间IL-10、IL-18和TGF-β水平均无统计学差异。

表2 各组CSF细胞因子水平（pg/mL）

2.3 细胞因子水平用于鉴别PD与AP的ROC曲线分析用ROC曲线分析细胞因子，以评估其鉴别各组患者的能力。当PD组与PSP组进行比较时，单个细胞因子中鉴别能力最强的是IL-4，AUC为0.79，IL-4低于截断值提示PD可能，敏感度为94.12%，特异度为 52.17%。此外 CRP、TNF-α、IL-1β和IL-6低于各自截断值也提示PD可能（表3，图1A，AUC＜0.7的数据未显示）；在MedCalc软件中通过建立logistic回归方程探索PD组与PSP组鉴别诊断的最佳细胞因子组合，最终纳入IFN-γ（X1）和 IL-4（X2）作为协变量，模型表达式为：logit（P）=2.52+5.63X2-2.65X2。将原始协变量X1和X2拟合成联合预测因子Pre 1，其对应AUC为0.88（表3，图 1B，P＜0.01，95%CI：0.77～0.95），Pre 1 大于截断值提示PD可能，敏感度为91.18%，特异度为82.61%。

表3 各指标以及联合检测对PD组和PSP组的鉴别诊断效能

当PD组与MSA组进行比较时，单个细胞因子中鉴别能力最强的是IL-4，AUC为0.74，IL-4低于截断值提示PD可能，敏感度为47.06%，特异度为94.44%。此外CRP低于截断值也提示PD可能（表 4，图 1C，AUC＜0.7 的数据未显示）；同样建立logistic回归方程探索PD组与MSA组鉴别诊断的最佳细胞因子组合，最终纳入 IFN-γ（X1）、IL-1β（X2）和 TGF-β（X3）作为协变量，模型表达式为：logit（P）=-10.04+7.57X1-5.25X2+0.01X3。将原始协变量X1、X2和X3拟合成联合预测因子Pre 2，其对应 AUC 为 0.96（表 4，图 1D，P＜0.01，95%CI:0.86～0.99），Pre 2大于截断值提示PD可能，敏感度为88.24%，特异度为94.44%。

图1 各指标ROC曲线 A为PD组与PSP组单个细胞因子的ROC曲线，B为PD组与PSP组联合细胞因子的ROC曲线，C为PD组与MSA组单个细胞因子的ROC曲线，D为PD组与MSA组联合细胞因子的ROC曲线。

表4 各指标以及联合检测对PD组和MSA组的鉴别诊断效能

3 讨论

在本研究中，与对照组相比，PD组IL-4显著减少。IL-4可诱导M2型小胶质细胞，与炎症抑制、免疫调节和组织修复等过程相关[15]，因此PD患者IL-4减少可能会加重神经元损伤。PD组与对照组其余细胞因子均无统计学差异。先前文献报道，与对照组相比PD患者CSF的IL-1β和TNF-α水平上调[16]。然而也有文献发现二者CSF的TNF-α水平无差异[17]。这可能与不同研究纳入对象的差异有关。MSA组与PD组或对照组相比，各细胞因子均无统计学差异，与先前的文献报告一致[18-19]。

与 PD 组相比，PSP组 CSF中 CRP、IL-1β、IL-4、IL-6和TNF-α的水平显著升高。PD和MSA的病理特征均是神经系统中异常聚集的α-突触核蛋白包涵体，前者包涵体位于神经元中[20]，而后者包涵体则位于少突胶质细胞[21]。不同于PD和MSA，PSP属于tau蛋白病，神经元和星形胶质细胞中可见病理性tau蛋白包涵体[22]。PSP组患者CSF中细胞因子较PD组与MSA组的高，可能是因为不同疾病病理上的差异导致了炎症反应及细胞因子的差异。CRP是一种急性期蛋白，在大脑内可以由神经元和神经胶质细胞生成[23-24]，与非运动症状如抑郁和痴呆等显著相关[25-26]。TNF-α和IL-1β是由活化的小胶质细胞表达的促炎性细胞因子，不仅诱导M1型小胶质细胞和维持慢性炎症[27]，还与tau蛋白的过度磷酸化修饰和神经元丢失有关[28]。此外，研究还发现tau蛋白可以诱导TNF-α和IL-1β的转录水平升高[29-30]。IL-6对中枢神经系统的影响是双向的。海马细胞经IL-6处理后可通过cdk5/p53等通路诱导tau蛋白的磷酸化来促进神经原纤维缠结形成[31]。在淀粉样前体蛋白转基因小鼠中过表达IL-6减少了β-淀粉样蛋白斑块的沉积，这可能是由于IL-6诱导M2型小胶质细胞激活，增强了对β-淀粉样蛋白的吞噬作用[32]。

本研究另一目的是评估所选细胞因子用于鉴别诊断PD与AP的能力。PD与MSA或PSP在疾病的早期常常表现出相似症状，准确的诊断将对临床评估、治疗和预后产生深远的影响。本研究中，利用 CSF中 IFN-γ、IL-1β和 TGF-β鉴别 PD组和MSA组患者敏感度和特异度分别为88.2%和94.4%，IFN-γ和IL-4鉴别 PD组和 PSP组患者敏感度和特异度分别为91.2%和82.6%。虽然腰椎穿刺实施的难度较高，在诊治过程中较采血不易被患者接受，然而PHILIPP等[33]的研究发现PD，MSA和PSP患者血清中174种细胞因子仅2种的表达发生明显变化，并且不能区分疾病。

本研究表明，PD和AP患者CSF中细胞因子水平在早期的临床鉴别诊断中有重要意义。通过联合检测细胞因子，可显著提高诊断结果的可靠性，有望成为临床辅助诊断的手段之一。本研究的不足可能在于：①相对较小的样本量；②诊断“金标准”需要神经病理学证据，可能存在错误的临床诊断。因此，更深入的PD和AP患者CSF细胞因子谱差异及诊断价值评估有待进一步的大样本量研究。