液液萃取—超高效液相色谱—串联质谱法快速检测原料乳中18种喹诺酮药物残留

周艳华 李 涛 潘小红 向 俊

(1. 长沙环境保护职业技术学院，湖南 长沙 410111；2. 湖南省食品质量监督检验研究院食品安全监测与预警湖南省重点实验室，湖南 长沙 410111；3. 湖南省药品检验研究院，湖南 长沙 410001)

牛奶中含有丰富的蛋白质、脂肪、维生素和矿物质等营养物质，是一种优质食品来源。随着生活水平的提高，乳制品受到人们青睐，乳品安全也受到社会广泛关注，而原料乳安全直接影响乳制品安全。喹诺酮药物是一种人工合成抗菌药物，具有抗菌谱广和价格低廉等特点，被广泛应用于动物疾病的预防和治疗[1-2]。药物滥用，会出现动物的毒性反应，且此类药物半衰期长，残留的喹诺酮药物会造成过敏，可能对人体造成肝肾功能损伤和神经中毒等不良反应[3-4]。欧美发达国家制定了多种喹诺酮类药物在动物组织中的最高残留量[5]。为加强兽药残留监控工作，保证动物性食品卫生安全，中国也修订了《动物性食品中兽药最高残留限量》[6]。

目前，喹诺酮药物残留的测定方法主要有高效液相色谱法[7-8]、酶联免疫法[9]、液相串联质谱法[10-11]等。液相色谱法灵敏度低，检测项目少，选择性差；ELISA法仪器化程度低、前处理简单，适用于现场大批量样品快速筛查，但灵敏度和准确度有待提高。液质联用法具有灵敏度高、选择好、重现性好等优点，是药物残留定量定性分析的首选方法。国家现有标准中检测动物源性食品中喹诺酮类化合物的标准有GB/T 20366—2006和GB/T 21312—2007。GB/T 21312—2007采用缓冲溶液提取和HLB固相萃取柱净化，前处理步骤繁杂，而GB/T 20366—2006未对牛奶基质进行验证研究，不适用于原料奶检测。目前报道的原料乳中多种喹诺酮药物残留净化方法包括HLB固相萃取柱法[12]、免疫固相萃取柱法[13]、QuEChERS法[14]等，其均通过液质联用仪进行检测。

试验拟采用液液萃取净化法进行前处理，并将该前处理技术与超高效液相色谱串联质谱相结合，用于大批量原料乳中18种喹诺酮类药物残留的快速检测，旨在为有效监控原料乳中喹诺酮药物提供依据，从而保证乳制品安全。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

原料乳：市售；

C18色谱柱：150 mm×2.1 mm，3 μm，美国赛默飞世尔公司；

乙腈、甲醇、乙酸乙酯：色谱纯，德国默克公司；

甲酸：优级纯，上海安谱实验科技股份有限公司；

恩诺沙星(CAS 93106-60-6，≥98%)、环丙沙星(CAS 85721-33-1，≥99.4%)、氧氟沙星(CAS 82419-36-1，≥99.7%)、诺氟沙星(CAS 70458-96-7，≥98%)、培氟沙星(CAS 70458-92-3，≥99.8%)、洛美沙星(CAS 98079-52-8，≥98%)、达氟沙星(CAS 112398-08-0，99.9%)、依诺沙星(CAS 74011-58-8，99.9%)、沙拉沙星(CAS 91296-87-6，97.7%)、双氟沙星(CAS 91296-86-5，96.2%)、司帕沙星(CAS 110871-86-8，99.9%)、吡哌酸(CAS 51940-44-4，98.0%)、西诺沙星(CAS 28657-80-9，98.0%)、萘啶酸(CAS 389-08-2，99.9%)、氟甲喹(CAS 42835-25-6，99.6%)、氟罗沙星(CAS 79660-72-3，99.2%)、奥比沙星(CAS 113617-63-3，97.1%)、麻保沙星(CAS 115550-35-1，99.9%)标准品：北京坛墨质检科技股份有限公司。

1.2 仪器与设备

超高效液相色谱串联三重四极杆质谱：TSQ Quantis型，美国赛默飞世尔公司；

电子分析天平：BSA224s型，赛多利斯科学仪器(北京)有限公司；

高速离心机：TG16-WS型，长沙市湘仪仪器有限公司；

超声波清洗器：2050T型，上海安谱实验科技股份有限公司；

高速振荡器：CM-1000型，东京理化器械株式会社。

1.3 质谱条件优化

在HESI离子源下，采用Full扫描和SRM扫描，毛细管电压3 500 V；汽化温度350 ℃；鞘气压0.24 kPa；辅助气压0.091 kPa；取标准溶液直接进质谱，通过Full扫描，确定电离模式和母离子m/z，通过SRM扫描，确认最优质谱条件。

1.4 液相色谱条件优化

在相同其他色谱条件下，优化流动相种类，优化的无机流动相为：5 mmol/L乙酸铵溶液、体积分数0.1%甲酸溶液、体积分数0.1%甲酸—5 mmol/L乙酸铵溶液，优化的有机流动相为：甲醇和乙腈，考察样品的分离效果与响应度。设定无机流动相为A相，有机流动相为B相；流速0.3 mL/min；色谱柱温35 ℃；进样体积5 μL。梯度洗脱程序：0.0～0.5 min，90% A；0.5～3.0 min，90%～70% A；3.0～7.5 min，70%～10% A；7.5～9.5 min，10% A；9.5～9.6 min，10%～90% A；9.6～12.5 min，90% A。

1.5 样品前处理工艺优化

精密称取混合均匀的原料乳2.0 g于50 mL离心管中(n=6)，加入3 mL 1#提取剂(分别为水、0.1%甲酸及0.2%甲酸)，振摇5 min，超声10 min，加入15 mL 2#提取剂(分别为甲醇、乙腈和乙酸乙酯)，振荡15 min，离心，取5.0 mL上清液氮吹至近干，15%甲醇水溶液定容至1.0 mL，过0.22 μm有机滤膜，测定并计算喹诺酮类化合物的回收率，确定最优提取溶剂。

1.6 方法学验证

取空白原料乳，配制质量浓度为2.0～100.0 ng/mL的基质标准线性系列溶液，制作标准曲线。在空白原料乳中添加低浓度混合标准溶液，按最优的前处理工艺处理后测定，S/N≥3的浓度为检出限(LOD)，S/N≥10的浓度为定量限(LOQ)。分别在原料乳中加入18种喹诺酮类混合标准溶液，加标后样品浓度分别为2.0，4.0，20.0 μg/kg(n=6)。测定18种喹诺酮药物残留含量，计算回收率和相对标准偏差值。

1.7 基质效应评价

取空白原料乳基质，配制空白基质混合标准系列溶液，同时配制相同浓度的溶剂标准系列溶液，经液质联用仪测定后得基质标准曲线和溶剂标准曲线。依据基质效应(ME)可由基质标准曲线斜率与溶剂标准曲线斜率百分比表示的方法反映每个喹诺酮化合物的基质效应[15-16]。

1.8 样品检测

取20批次原料乳，用所建立的检测方法检测样品中18种喹诺酮类化合物，判定样品中是否有喹诺酮药物残留。

1.9 数据处理

采用Excel软件对试验数据进行处理，分析准确度、精密度、检出限、定量限及回收率。

2 结果与讨论

2.1 质谱条件优化

经Full扫描得知，18种喹诺酮类化合物在正离子模式下响应值最高，通过SRM扫描，得到喹诺酮化合物母离子、子离子及相应最佳碰撞电压、RF-lens电压，选择信号强度最高的子离子为定量离子。18种喹诺酮类化合物质谱参数见表1。

表1 18种喹诺酮类化合物的质谱参数表†

2.2 液相色谱条件优化

在最优质谱、色谱条件下，18种喹诺酮化合物的定量离子提取色谱图见图1。由图1可知，18种喹诺酮在12.5 min 内得到了有效分离。当无机流动相分别为5 mmol/L 乙酸铵溶液、体积分数0.1%甲酸溶液、体积分数0.1%甲酸—5 mmol/L乙酸铵溶液时，有机流动相为甲醇、乙腈、体积分数0.1%甲酸—乙腈均能分离出18种喹诺酮类化合物，但存在峰形、分离度及响应度的差异。当无机流动相为体积分数0.1%甲酸—5 mmol/L乙酸铵溶液时，喹诺酮化合物的分离度及峰形较好，有机流动相为乙腈时，化合物分离效果及响应值最高。由于所测喹诺酮化合物种类较多，低浓度的乙酸铵溶液可改善喹诺酮化合物的峰形，使峰型更尖锐，分离度更好，低浓度甲酸可为喹诺酮化合物电离时提供质子。有机流动相为甲醇时，组分色谱峰形易变宽，组分分离度低，而乙腈作为有机流动相时可明显改善酸喹诺酮化合物的峰形，因此最佳的色谱条件为体积分数0.1%甲酸—5 mmol/L乙酸铵—乙腈。

图1 18种喹诺酮类混合标准溶液定量离子色谱图

2.3 1#提取剂优化结果

由图2可知，3种1#提取剂中，15种喹诺酮化合物的回收率存在差异，萘啶酸、吡哌酸、氟甲喹3种化合物的回收率无显著差异，其他化合物经水提取后回收率最高，为75%～110%，0.2%甲酸水溶液的最低。1#提取剂主要将待测物中目标化合物溶解分散，通过超声波辅助提取，利用超声波的空化作用提高样品中的喹诺酮化合物的运动速率和穿透力，从而提高回收率。加入甲酸后，降低了提取溶液的pH值，使原料乳中蛋白质凝聚，吸附了喹诺酮，从而影响了回收率。试验不采用常用的兽药残留缓冲液提取液如Na2EDTA-Mcllvaine缓冲溶液和磷酸盐缓冲溶液，因液液萃取净化法会将难挥发的钠盐带入质谱，影响质谱的灵敏度，因此选择最优的1#提取剂为水。

图2 1#提取剂对喹诺酮回收率的影响

2.4 2#提取剂优化结果

由图3可知，选择水作为1#提取剂，3种2#提取剂中，乙腈提取后喹诺酮化合物回收率最高，乙酸乙酯提取后目标化合物回收率最低，2#提取剂对吡哌酸、萘啶酸、氟甲喹3种化合物的回收率影响不显著。兽药残留最常用的提取剂包括甲醇、乙腈和乙酸乙酯，三者中乙腈极性最大，乙酸乙酯极性最小，喹诺酮化合物为酸碱两性化合物，易溶于水，经1#超声提取后，喹诺酮化合物已分散在水性介质中，因此乙酸乙酯提取回收率低，甲醇提取时水溶性蛋白进入提取液中，影响了目标化合物的电离，回收率不高。乙腈具有沉淀蛋白作用，经乙腈提取后溶液中的蛋白质、脂肪含量大大降低，基质干扰减少，从而提高了回收率。

图3 2#吸附剂对喹诺酮回收率的影响

2.5 线性关系、检出限和定量限结果

由表2可知，当质量浓度为2.0～100.0 ng/mL时，18种喹诺酮化合物的线性关系良好(R2≥0.992)，检出限(LOD)为0.02～0.50 μg/kg，定量限(LOQ)为0.06～1.50 μg/kg，此方法所得大部分喹诺酮化合物的检出限和定量限优于GB/T 20366—2006和 GB/T 21312—2007的。不同喹诺酮化合物的分子量和结构不同，在同一条件下的响应度和信噪比不同，因此检出限和定量限也不同。

表2 喹诺酮化合物的标准曲线方程、相关系数、检出限和定量限

2.6 准确度和精密度结果

由表3可知，当喹诺酮加标浓度为2.0 μg/kg时，回收率为74.0%～100.6%，相对标准偏差RSD为2.0%～12.5%；当喹诺酮加标浓度为4.0 μg/kg时，回收率为76.7%～100.0%，相对标准偏差RSD为1.8%～13.0%；当喹诺酮加标浓度为20.0 μg/kg时，回收率为80.0%～106.5%，相对标准偏差RSD为1.1%～10.2%。3个梯度加标回收率和精密度良好，回收率符合GB/T 27404—2008中当加标浓度<0.1 mg/kg时，回收率为60%～120%的要求。因18种喹诺酮化合物的定量限不同，为使准确度试验覆盖所有喹诺酮化合物，采用浓度较高的依诺沙星的定量限为最低加标浓度，分别以定量限、2倍定量限和10倍定量限浓度进行加标试验，结果表明试验建立的方法满足原料乳中18种喹诺酮化合物的测定。

表3 喹诺酮化合物的回收率和精密度

2.7 基质效应评价

由图4可知，吡哌酸和西诺沙星表现为基质增强效应，其他喹诺酮化合物的基质效应均在80%～120%，表现为基质效应不明显。该方法中有两种化合物的基质效应明显，为保证所有化合物检测结果的准确性，仍采用基质标准曲线，非测定吡哌酸和西诺沙星，可以选用溶剂标准曲线。因液相色谱—串联质谱仪的离子源结构特点，不可避免地会出现基质效应，并对目标化合物的灵敏度、准确度和方法的重现性等产生影响。通常采用不同净化工艺、同位素内标及基质标准曲线来减少基质效应，试验采用液液萃取法净化了原料乳中的蛋白质、脂肪基质，且结果表明此研究方法中大部分喹诺酮类化合物基质效应不明显，说明前处理工艺能够最大限度地净化基质，保证检验结果的准确性。

图4 18种喹诺酮化合物的基质效应

2.8 方法运用

为验证方法的有效性，采用所建立的方法对市售的20批原料乳进行检测，样品中均未检出上述18种喹诺酮类化合物，且质控样品加标回收率符合GB/T 27404—2008要求，表明结果准确可靠。说明原料乳中喹诺酮化合物残留风险较小，后续将选择不同来源的原料奶进行检测。

3 结论

建立了同时快速检测原料乳中18种喹诺酮类药物残留的超高效液相色谱串联质谱法。采用液液萃取法提取净化样品，并对线性方程、检出限、定量限、回收率等方法学指标进行了验证。结果表明，与国家标准相比，此研究验证了原料乳中喹诺酮化合物的检测方法，增加了所检测目标化合物的数量，定量限优于国家标准，在不影响准确度的情况下采用液液萃取工艺，大大缩短了检验时间，提高了检验效率，降低了成本，提高了检测通量，且基质效应不明显。该方法作为批量快速检测原料乳中18种喹诺酮类化合物定量检测方法，具有简单高效、灵敏度高等优点。