杜氏肌营养不良症家系致病基因的遗传学研究

徐 盈,宋婷婷,郑 娇,郭芬芬,黎 昱,张建芳,李 佳,金 鑫,杨 红

(空军军医大学第一附属医院妇产科,西安 710032;*通讯作者,E-mail:yanghongfck@163.com)

杜氏肌营养不良症(Duchenne muscular dystrophy,DMD)是一种以进行性骨骼肌无力和肌细胞死亡为特征,肌细胞被脂肪和结缔组织代替的致死性X连锁隐性遗传病[1,2]。患儿主要临床表现小腿肥大、关节挛缩和进行性肌无力,血清肌酸激酶(creatine kinase,CK)明显升高,患有DMD的男孩可能会出现不同程度的语言延迟、学习障碍和/或认知障碍。多数患儿在7-13岁时丧失行走能力,且在十几岁或二十几岁死于心肺衰竭[3,4]。该病的发生是由于肌营养不良蛋白(dystrophin)的缺乏破坏了肌膜的稳定性,导致运动发育延迟[5]。dystrophin在肌肉中起着重要的结构作用,它是连接细胞外基质及肌动蛋白细胞骨架的桥梁。dystrophin的氨基末端与肌动蛋白结合,而羧基末端与肌营养不良蛋白相关的蛋白复合物(DAPC)在肌膜外结合。DAPC包括营养不良聚糖、肌糖蛋白、整联蛋白和小窝蛋白,这些成分中的任何一种突变都会导致遗传性肌营养不良症[6,7]。尽管治疗DMD药物在一定程度改善患者的生存质量,但是至今仍然无法彻底治愈[8,9]。研究发现位于Xp21染色体上的抗肌营养不良蛋白基因(dystrophin gene,DMD)突变是导致该疾病发生的主要原因。据报道约60%的患者存在DMD基因的缺失,6%为重复,其余30%为微小突变,包括点突变、小缺失或小插入(see Leiden muscular dystrophy pages at http://www.dmd.nl)[10,11]。由于该病危害大且突变类型较多,明确DMD家系患者的致病基因,对有再生育需求的家庭进行产前基因诊断是十分重要的。为此,本研究应用一代测序法和肌肉组织mRNA水平测序方法对2个均生育过DMD患儿的家庭进行基因诊断评估其致病因素,明确受检者基因型后,对高风险胎儿进行产前基因分析,以期达到避免DMD患儿出生的目的。

1 资料与方法

1.1 临床资料

采集2例家系的病史资料,包括一般信息、出生史、发病年龄、家族史、个人史、母亲孕产史等,以上家系均否认近亲结婚,否认不良接触史。所有程序均经空军军医大学第一附属医院医学伦理委员会批准(批准号:KY202003044-1),全部检测者签订知情同意书。

1.2 样本的采集

1.2.1 外周血采集 用一次性无菌注射器取受试者静脉血4 ml,与含有EDTA抗凝紫色收集管内,4 ℃保存备用。

1.2.2 羊水样本 孕妇在签署知情同意书的情况下,在无菌消毒条件下,孕妇排空膀胱,平卧位,找好穿刺点及穿刺方向,消毒铺无菌洞巾,在超声诊断仪引导下经腹壁行羊膜腔穿刺术,一次性无菌注射器缓慢抽取羊水10 ml。

1.2.3 胎儿组织样本 孕妇排空膀胱,平卧位,无菌消毒条件下,在B超定位下经腹部行绒毛活检术取绒毛组织,或者肌肉活检术,使用双针18号针进行引导,第二针20号针(Modena,PNM0418-1)进行胎儿肌肉活检。穿刺针必须经过肝素处理,以避免组织凝块,并直接位于胎儿大腿肌肉上方。然后将标本迅速放置于液氮中冷冻送回检测室,生理盐水冲洗两次后,手术剪刀将标本切成小块,进一步进行基因分析,按照文献12报道的方法[12]。

1.3 Sanger测序

血液基因组DNA提取采用西安天隆科技有限公司的全自动核酸提取仪(NP986-S)，采用分光光度计和0.8%的琼脂糖凝胶电泳进行DNA。PCR反应程序为：95 ℃ 11 min(94 ℃ 1 min，62 ℃ 75 s，72 ℃ 100 s)10个循环，每循环退火温度降低1 ℃、延伸时间延长2 s；降至50 ℃后再进行(95 ℃ 1 min，50 ℃ 90 s，72 ℃ 30 s)25个循环；65 ℃延伸20 min；4 ℃保存。扩增产物送上海生工有限公司直接测序，参考序列为NM_004006.2。

1.4 肌肉组织mRNA测序分析

RNA提取肌肉组织RNA的提取应用TianGen RNA提取试剂盒(TianGen,DP419),使用PrimeScriptTM试剂(Takara Dalian,RR036A)将总RNA进行反转录。总RNA进行反转录,DMD转录本通过PCR扩增覆盖整个编码区域,扩增产物送上海生工有限公司直接测序,按照文献[12]报道的方法,DMD参考序列为NG-012232.1。

1.5 突变分析

测序序列应用Vector NTI 11.5软件进行分析,通过与美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information, NCBI)、国际公共数据库(ClinVar)及在线人类孟德尔遗传数据库(Online Mendelian Inheritance in Man, OMIM)等公共数据库进行比对分析判断其致病性。

1.6 产前基因诊断

选用STRMP、STR44、STR49结合AMEL四个位点进行短串联重复序列STR多态位点连锁分析,排除母体污染,参照文献[13]报道的方法。

1.7 随访

每半年通过电话进行随访。

2 结果

2.1 DMD家系可疑致病性突变位点的确定

1号家庭:孕妇(Ⅱ-3)32岁,孕13周,孕1产0,孕妇本人及丈夫正常,其姐姐(Ⅱ-1)生一男孩为DMD患者(Ⅲ-1),7岁时夭折,主诉患儿出生20 d左右双腿无力,哭声减弱,伴有先天性心脏病,肌酸激酶检测增高,高度怀疑为进行性营养不良(见图1A)。1号家庭由于先证者7岁时已经死亡现在无法获得其标本,我们采用一代测序方法对孕妇本人及姐姐样本进行基因检测,结果发现1号家庭孕妇本人及姐姐在DMD基因均存在c.2717-2721dupTCCTG移码突变,检测结果在LOVD基因突变数据库进行检索分析,c.2717-2721dupTCCTG在数据库中未见报道,为移码突变,可能导致mRNA编码提前终止,可能与Duchenne型肌营养不良症发生密切相关,孕妇本人及姐姐可能为DMD携带者(见图1B),推测男性患者可能遗传该突变导致疾病的发生。

2号家庭:孕妇(Ⅱ-1)34岁,孕18周,孕2产1,育一子患有DMD,现年11岁,患儿3岁半时出现走路易摔跤,上楼梯无力,肌酸激酶检测为3 813 U/L(正常值:37-174 U/L,见图2A)。DMD基因DNA水平上未鉴定出2号家庭的致病变异,与家属充分沟通且获得同意后,采集2号家庭先证者(Ⅲ-1)的肌肉组织,进行全RNA提取,反转录获得cDNA,DMD基因mRNA的分段扩增,发现先证者(Ⅲ-1)样本DMD基因exon38至exon39扩增片段较对照片段大,怀疑这一区域存在插入变异。进一步BLAST分析发现在外显子38和39之间插入了66个核苷酸(r.5448-5449insMW025259:r124-189),该66个核苷酸来源于DMD基因的内含子38(NG-0122 32.1:g.996205-g.996270)。该插入片段使得外显子38和39的阅读框发生位移,产生了一个提前终止密码子(UAA),阻碍了蛋白质的正常翻译(见图2B,C),该变异通过数据库和文献检索尚未报道,为新发突变。

图2 肌肉组织mRNA水平测序对2号家庭致病基因的遗传学分析结果Figure 2 Genetic analysis of the disease-causing genes of family 2 by muscle tissue mRNA level sequencing

2.2 DMD阳性家族史产前诊断结局

2例DMD阳性家族史的家庭均有再生育需求,分别应用一代测序和通过DMD基因mRNA的分段扩增方法对2个家庭进行产前诊断,1号家庭通过绒毛活检术取绒毛组织,发现该胎儿(Ⅲ-2)为男性且在DMD基因上存在c.2717-2721dupTCCTG的突变(见图3A),遗传自母亲,推测胎儿有较高的患病风险,1号家庭选择终止妊娠,胎儿未出生。2号家庭孕妇接受充分遗传咨询后选择在B超定位下经腹部行胎儿肌肉活检术,取胎儿(Ⅲ-2)大腿内侧肌肉组织进行产前基因诊断,结果显示2号家庭胎儿男性,但DMD基因序列未见异常,胎儿出生后随访为健康男婴,足月出生,体质量3.125 kg,复查血清肌酸激酶水平正常,表型未见明显异常(见图3B),至今已1.5周岁,随访一切正常。

蓝色线为孕妇峰型，红色线为胎儿峰型。胎儿为1个峰来自母亲，说明取材样本没有母源污染图3 2个家庭产前诊断结果Figure 3 Results of prenatal diagnosis in two families

3 讨论

DMD是破坏性的进行性神经肌肉疾病,患者多数为男性,在儿童早期出现近端肌无力,未经治疗的男孩在12岁时就被限制在轮椅上,并在青少年晚期到20岁出头时死于心肺并发症[1,8]。该疾病主要通过糖皮质激素治疗,预防挛缩,以及心肌病和呼吸损害的医疗护理[14]。到目前为止,可供临床治疗的方法非常有限,尚无有效的治疗方法[15]。

基因突变是否会破坏阅读框结构决定了患者病情的严重程度,因此明确患者的致病基因,对于最终诊断,指导适当的临床治疗以及提供进一步的产前诊断和遗传咨询至关重要[6,16]。研究表明DMD基因突变是导致该疾病的主要原因,该基因是已知的最大的人类基因之一,全长约2.4 Mb,包含79个外显子,最常见的致病突变是基因内缺失/重复,占60%-65%。剩余的突变是无义突变、错义突变、剪接位点突变、移码小的缺失或插入以及产生隐藏外显子中内含子变异[17]。根据DMD基因突变类型随之出现多种分子学检测方法包括STR基因连锁分析、多重连接依赖性探针扩增(MLPA)、多重PCR联合变性高效液相色谱法(PCR-DHPLC)技术、二代测序(NGS)以及Sanger测序等。Dinh等[18]成功地通过STR基因连锁分析方法对5个DMD家系进行诊断和产前诊断。该方法可以确定具有疾病风险的X染色体的来源,但很可能会得出错误的结论,而又不知道该孕妇是散发性还是生殖细胞镶嵌突变的DMD携带者。Zhang等[19]通过应用多重连接依赖性探针扩增(MLPA)和高通量测序方法(NGS)对62例患者进行诊断。2017年我们通过变性高效液相色谱(DHPLC)和Sanger测序对237例胎儿进行了DMD产前诊断,14例胎儿异常,18例为携带者[20]。MPLA和PCR-DHPLC方法可以有效地检测DMD基因外显子中的缺失/重复突变,但无法在所有外显子区域中发现点突变,需要结合Sanger测序。NGS技术在一次检测中同时检测多个基因具有很大的优势[21,22]。但由于对临床实验室条件的高度要求和极其复杂的数据处理,NGS的应用受到了限制。为了快速明确患者的致病突变从而缩短胎儿产前基因诊断的时间,目前多采用MLPA或者DHPLC方法首先判断是否存在缺失或者重复,其次考虑小突变,这些方法可以帮助临床医生发现大多数患者的致病性突变。在本组研究中由于1号家庭先证者的生物样本无法获取,我们通过Sanger测序方法对孕妇本人及姐姐进行检测,发现孕妇和姐姐的样本均存在DMD基因c.2717-2721dupTCCTG移码突变,该突变在数据库中未见报道,为新发突变。我们主要结合四点进行致病性判断:①新发突变在Pubmed,Clinvar, LOVD等数据库是否有报道;②通过Mutation Taster、SIFT和polyphen2软件预测基因突变效应;③该突变位点的改变是否影响氨基酸的改变;④在人群中发生频率是否极低。在本组研究中DMD基因c.2717-2721dupTCCTG移码突变在公共数据库中尚未报道,通过Mutation Taster软件预测可能致病,且在人群中发生频率比较低,依据美国医学遗传学与基因组学学会指南,该新发突变评级为致病突变,可能是导致先证者发病的主要原因,孕妇本人及姐姐为DMD的携带者。对于既往生育过DMD患儿的妇女或女性携带者,其生育DMD男性的风险为25%[23]。因此,对该孕妇进行了绒毛活检术取胎儿样本进行DMD基因诊断结果发现该男性胎儿绒毛样本在DMD基因上同样存在c.2717-2721dupTCCTG的突变,可以推测胎儿患病风险较高。从以上研究结果可以看出,尽管在本组研究无法获得先证者的生物医学样本,但通过明确携带者基因型反推先证者可能的基因型对于快速、准确地进行DMD产前诊断具有积极的临床指导意义。

此外,研究发现大约1%-2%的进行性营养不良患者主要是由深层内含子改变或其他调节改变引起的[24-26]。这些突变改变了mRNA的正常处理过程,因此对于少数病例我们应该考虑DMD基因mRNA水平的变化。在临床工作中,我们通过常规方法(MPLA,DHPLC和Sanger测序分析)在2号先证者样本中没有发现可疑的致病性改变。我们先前的研究报道通过mRNA分析方法在2例DMD患者的肌肉组织样本发现2个插入异常转录本[12]。根据既往经验取2号家庭先证者的肌肉组织进行DMD基因mRNA水平的检测,发现先证者DMD基因在外显子38和39之间插入了66个核苷酸((r.5448-5449insMW025259:r124-189),该插入序列来源于DMD基因的内含子38(NG-0122 32.1:g.996205-g.996271),产生一个额外的“外显子”且提早出现终止密码子,该插入变异文献检索尚未报道,属于新发突变,其在人群中发生频率较低,依据美国医学遗传学与基因组学学会指南,该新发突变评级为可能致病突变,结合临床表型、家族史以及变异评估该突变可能是与DMD发生密切有关。由于孕有DMD高风险胎儿的孕妇对进行DMD产前诊断具有极其强烈的意愿,我们尝试通过胎儿肌肉活检术采集男性胎儿大腿内侧肌肉组织进行了产前基因诊断,结果显示该胎儿基因型未见异常,出生后随访一切正常,通过本组研究表明对于部分病例在DMD基因DNA水平无法鉴定要突变位点,结合患者临床表现、生化指标、病理指标及家族史对于高度患有为DMD的可考虑mRNA水平变化的分析。

总之,对于曾经生育过DMD患儿的家系采取针对性的DMD基因检测策略,可快速、准确地做出判断,为该疾病的产前诊断提供可能和有效的保证,降低患儿的出生,提高出生人口的质量。