α1-肾上腺素能受体对大鼠室性心律失常的调节作用

刘 通,王 利,史静怡,闫泱锦,程 康,冀永春

(西安市第三医院心血管内科,西北大学附属医院心血管内科,西安 710018;*通讯作者,E-mail:18629057123@163.com)

心脏性猝死(sudden cardiac death,SCD)是由心功能丧失引起的突发性意外死亡[1]。大多数情况下室性心律不齐(ventricular arrhythmias,VA),尤其是室性心动过速、室颤[2]和致死性心律失常是造成心脏性猝死的主要原因。由于死亡的发生有时仅需几分钟甚至几秒钟,因此明确致死性、室性、快速性心律失常发生的功能指标对于确定临床诊断和法医鉴定都很重要[3]。

肾上腺素能受体(adrenergic receptors,AR)是能与去甲肾上腺素(noradrenaline,NE)或肾上腺素结合的受体,是一种定位在细胞膜上的大分子蛋白质或脂蛋白,主要分为β-AR和α1-AR[4]。其中,β-AR介导心脏的主要功能,所占比例也较多,但在心衰等病理条件下受体会脱敏下调,而α1-AR表达可上调至25%(9%-45%)[4]。研究表明,AR是一种介导儿茶酚胺作用的G-蛋白偶联受体,是近年来的研究热点,也是最成功的药物靶点之一[5]。目前有超过50%的临床用药,以及正在研发的药物靶点都是G蛋白偶联受体[6]。近年来关于β-AR对大鼠心脏病理的研究较多,如心脏炎性细胞浸润和促炎细胞因子的合成在β-AR介导的心脏重塑和心力衰竭中发挥了重要作用[7];β1-AR募集巨噬细胞至心脏,引起心脏炎症及心脏纤维化和心功能异常等[8]。但是仅有少数关于α1-AR介导的心脏炎症中的作用的研究[9]。目前尚缺乏关于去甲肾上腺素调节α1-肾上腺素能受体对大鼠室性心律失常影响的研究。因此本研究利用NE诱导VA大鼠模型,通过给予α1-AR拮抗剂,检测α1-AR与大鼠心脏室性心律失常的关系,以期明确VA大鼠心肌中α1-AR是否引起ERK1/2通路激活,为交感应激引起的病理性室性心律失常寻找更为精确的临床治疗靶点。

1 材料和方法

1.1 实验材料

RNAiso Plus(D9108;Takara Biotechnology,Shiga),去甲肾上腺素(Macklin,N814761),PrimeScript RT试剂盒(DRA037,Takara),SYBR Premix Ex TaqⅡ(TliRNaseH Plus; RR820A,Takara),COMT酶(Bioruler,RH126075-150U),放射免疫沉淀缓冲液(sc-24948,Santa Cruz),牛血清白蛋白(SK3051,Sangon Biotech),PNPP(MedChemExpress,HY-15928),抗p-ERK1/2(ab1549,Abcam),抗GAPDH(ab8245,Abcam),山羊抗兔IgG(ZB2301,北京)。鼠尾血压计(Softron,Japan,BP-98A)。

1.2 实验分组及处理

30只体质量300-350 g的SD雄性大鼠购自兵器工业卫生研究所[SCXK(陕)2016-001]。饲养环境为室温23 ℃、相对湿度65%,12 h光照/黑暗交替,期间大鼠可随意获取食物和水。将大鼠随机分为3组:对照组、去甲肾上腺素组(NE组)和α1-AR拮抗剂处理组(NE+P组),每组10只。根据赵艳丽等[10]方法建立室性心律失常大鼠模型,NE组大鼠腹膜内注射2%戊巴比妥钠(1.5 mg/100 g体质量)麻醉后,通过微量注射泵以0.004 ml/100 g体质量的剂量行静脉内注射浓度为10-5mol/L的去甲肾上腺素(NE),建立大鼠室性心律失常模型,对照组大鼠则注射等体积的生理盐水。然后使用Powerlab生物信号处理系统(Bella Vista)持续记录大鼠心率的心电图(ECG)信号。NE+P组大鼠在注射NE 15 min前,α1-AR拮抗剂哌唑嗪(Praz)以5 mg/kg的剂量行腹腔注射到大鼠体内。在将大鼠麻醉后,通过微量注射泵行静脉注射浓度为10-5mol/L的去甲肾上腺素。用鼠尾血压计BP-98A检测大鼠血压,用含1%的戊巴比妥钠腹腔注射麻醉大鼠(0.1 ml/10 g),将鼠尾放入感应器中,开始检测给药前后大鼠心率、收缩压、舒张压,连续测量至少5次。

1.3 血浆中去甲肾上腺素含量测定

在注射NE后1 h和24 h时,分别于各组大鼠颈静脉处采集血液,2 000 r/min离心20 min后收集上清,-80 ℃下保存待用。加入新配制的COMT酶溶液(2.5 ml辅酶液、2.5 ml酶缓冲液和0.8 ml COMT附加液加入2.5 ml COMT酶溶液中混匀)、标准品、质控品、血浆样本各25 μl/孔于酶标板中,混匀,可见其颜色变为粉红色。然后加入50 μl去甲肾上腺素抗血清,封板后于室温摇床孵育2 h,将0.1 ml酶连接产物加入各孔,再封板摇床孵育1 h,再加入0.2 ml底物溶液于各孔,孵育40 min,最后加入50 μl PNPP终止液,混匀后于60 min内用酶标仪于405 nm处检测OD值,计算血浆去甲肾上腺素浓度。

1.4 RNA提取和实时定量聚合酶链反应检测α1-AR基因表达水平

在注射NE后1 h时,行颈椎脱臼法处死大鼠,分离心脏,以生理盐水灌洗后,取100 mg大鼠的心肌组织在液氮中冷冻后进行研磨。用RNAiso Plus提取总RNA,并采用Prime Script RT试剂盒逆转录成cDNA。使用SYBR Premix Ex TaqⅡ和real-time PCR system(Thermo Fisher)进行实时qPCR,每组重复3次。GAPDH作为内参基因,通过2-ΔΔCt方法定量基因表达相对量。本研究所用的PCR引物序列如下:GAPDH F:5′-CTCCTGTTCGACAGTCAGCC-3′,R:5′-TTCCCGTTCTCAGCCTTGAC-3′;α1-AR F:5′-TGACTTTCCGCGATCTCCTG-3′,R:5′-TTACCTGCCACGGCCATAAG-3′。

1.5 蛋白质免疫印迹分析p-ERK1/2蛋白表达水平

大鼠心肌组织用预冷的磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤,并用含有10 μg/ml蛋白酶抑制剂的RIPA免疫沉淀缓冲液裂解。4 ℃下12 000 r/min离心10 min,收集上清液,以牛血清白蛋白为标准,测定上清液中的蛋白质含量。然后对蛋白质进行SDS-PAGE电泳,再进行蛋白质印迹。将电泳胶放置于用甲醇侵泡的PVDF膜上,倒入预冷转膜液,200 mA恒流转膜2 h。然后将膜置于5%脱脂牛奶中于摇床(240 r/min)室温封闭1 h,加入一抗p-ERK1/2(1 ∶500)和GAPDH(1 ∶5 000)的稀释比例在4 ℃下孵育过夜。用0.1% TBST洗膜10 min后加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG(1 ∶5 000),在室温下孵育。2 h后使用增强的化学发光检测系统,电泳凝胶成像分析系统(MF-ChemiBIS 3.2)将印迹可视化,并计算灰度值。

1.6 统计学分析

使用SPSS 21.0和GraphPad Prism 5软件进行数据统计分析,所有数据表示为平均值±标准差,两组数据采用t检验比较差异性,多组数据采用单因素方差分析的Tukey法或Dunnett-t法进行多组比较差异性。P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 NE注射后大鼠血浆NE水平和心率变化

在NE注射1 h时,NE组大鼠血浆中的NE水平相较于对照组显著升高[(15.08±0.39)mol/Lvs(2.98±0.51)mol/L,P<0.05];NE注射24 h时,NE组大鼠血浆中NE水平相较于1 h已明显下降,但与对照组相比仍显著升高[(8.02±0.31)mol/Lvs(2.98±0.51)mol/L,P<0.05]。大鼠的心电图监测结果显示,NE注射1 h时,NE组大鼠的持续性室性心律失常发生次数相较于对照组显著增加;NE注射24 h时,NE组大鼠的持续性室性心律失常发生次数相较于1 h已显著下降(见图1)。该结果表明本研究给大鼠注射NE后构建大鼠室性心律失常模型成功。

A.NE注射1 h和24 h后大鼠血浆中的NE水平B.NE注射1 h和24 h后大鼠的心电图变化与对照组比较,*P<0.05;与NE 1 h组比较,*P<0.05图1 大鼠注射NE后血浆中NE水平和心电图(ECG)检测Figure 1 NE levels in plasma and ECG after NE injection in rats

2.2 NE对室性心律失常大鼠α1-AR基因表达的影响

在NE注射1 h时,与对照组相比,NE组大鼠心肌组织中α1-AR mRNA的表达量显著上调(0.40±0.07vs2.18±0.3,P<0.01,见图2),由此说明NE诱导了室性心律失常大鼠中α1-AR的高表达,可能对大鼠室性心律存在调控作用。

与对照组比较,**P<0.01图2 NE注射1 h后大鼠心肌中α1-AR基因表达量的变化Figure 2 Changes of α1-AR gene expression in rat myocardium at 1 h after NE injection

2.3 室性心律失常大鼠中ERK1/2信号通路的激活

磷酸化ERK1/2蛋白的表达水平结果显示,与对照组相比,NE组大鼠心肌组织中p-ERK1/2蛋白的表达水平显著上调(0.36±0.09vs2.61±0.28,P<0.01,见图3)。该结果表明NE诱导的α1-AR可能激活ERK1/2信号途径。

与对照组比较,**P<0.01图3 NE诱导的α1-AR对室性心律失常大鼠中ERK1/2信号途径的影响Figure 3 Effect of NE-induced α1-AR on ERK1/2 signaling pathway in ventricular arrhythmic rats

2.4 α1-AR拮抗剂的使用对室性心律失常大鼠心率和血压的影响

α1-AR拮抗剂(哌唑嗪)使用后,NE组大鼠表现为血压升高和持续性单形性心动过速,NE+P组大鼠室性心律失常则有所减缓,表现为室性心动过速的波形。与NE组比较,NE+P组大鼠的收缩压和舒张压均呈明显降低(P<0.01,见图4)。表明α1-AR拮抗剂对室性心律失常大鼠心率和血压有明显改善作用。

与NE组比较,*P<0.05,**P<0.01图4 α1-AR拮抗剂使用后对室性心律失常大鼠心率和血压的变化Figure 4 Changes of heart rate and blood pressure in rats with ventricular arrhythmia after using α1-AR antagonist

2.5 α1-AR拮抗剂使用对室性心律失常大鼠ERK1/2信号途径的影响

使用α1-AR拮抗剂后,NE+P组大鼠中p-ERK1/2蛋白表达水平相较于NE组显著下调(2.61±0.28vs0.28±0.05,P<0.01,见图5)。该结果表明α1-AR在NE诱导的大鼠室性心率失常中具有重要的调节作用,ERK1/2信号通路的激活也可能受到α1-AR的调节。

与NE组比较,**P<0.01图5 α1-AR拮抗剂使用后对室性心律失常大鼠ERK1/2信号途径的影响Figure 5 Effect of α1-AR antagonist on ERK1/2 signaling pathway in rats with ventricular arrhythmia

3 讨论

肾上腺素能受体可以分为肾上腺素能α受体和β受体[11]。α受体(α1和α2)主要分布在皮肤、肾脏、肠胃的血管平滑肌。其中α1主要位于突触前膜和血管平滑肌上,兴奋时主要收缩血管[12]。α2主要位于去甲肾上腺素能神经的突触前膜上,兴奋时负反馈调节NE的分泌。β受体主要位于心脏、骨骼肌、肝脏的血管平滑肌[13]。β-AR所占比例较多并参与心脏的主要调节功能,但在心衰等病理条件下受体会脱敏下调[14]。而α1-AR表达上调至25%,并可通过偶联Gq蛋白激活磷脂酶C(PLC),分解磷脂酰肌醇4,5-二磷酸(PIP2)为三磷酸肌醇(IP3)和甘油二脂(DG),IP3使细胞内外Ca2+大幅度升高从而造成心肌损伤[15]。目前关于α1-AR与室性心律失常的研究已存在诸多报道,而交感过度激活和儿茶酚胺释放增加是引起心肌损伤的重要因素。且研究发现用去甲肾上腺素制备交感应激的动物模型可以检测到心脏白细胞浸润[16]。因此,本研究使用NE诱导大鼠室性心律失常的动物模型对去甲肾上腺素调节α1-肾上腺素能受体和其可能的机制进行研究和探索。

血浆NE水平与慢性心力衰竭的进展和预后相关[17]。随着血浆NE水平的增加,心力衰竭患者的死亡率也随之增加[18]。研究表明,NE会促进心脏炎症和收缩功能障碍的发展[9],从而导致心肌细胞损伤。相似的,本研究也发现在注射NE 1 h后,大鼠血浆中的NE水平相较于对照组显著升高,24 h后大鼠血浆中NE水平明显下降,但仍显著高于对照组。对大鼠的心电图进行监测的结果发现,NE注射后大鼠的室性心律失常发生次数较对照组明显增加。由此表明注射NE可以引起大鼠血浆NE水平的升高,且室性心率失常也随之加重。

研究发现,给予β-AR选择性激动剂的大鼠心脏出现了炎性细胞浸润和促炎细胞因子合成的增加[19],促炎细胞因子可能在β-AR介导的心脏重塑和心力衰竭中发挥了重要作用[7]。激活心肌细胞β1-AR使巨噬细胞募集至心脏,引起心脏炎症及心脏纤维化和心功能异常[8]。然而心肌细胞中表达的主要肾上腺素受体亚型除了β-AR还有α1-AR,目前仍不清楚α1-AR是否参与介导交感应激所引起心脏室性心律失常。针对NE是否通过AR作用来调节大鼠室性心率的发展,本研究检测了NE注射后产生VA的大鼠心肌中α1-AR基因的表达量,结果表明,NE可以显著提高α1-AR的表达,从而说明α1-AR可能参与了大鼠室性心律失常的调节作用。

哌唑嗪(prazosin)是一种α受体拮抗剂,主要用于高血压、焦虑和创伤后应激障碍。拮抗血管平滑肌中的α-AR,从而抑制循环和局部释放的肾上腺素和去甲肾上腺素的血管收缩作用,导致外周血管舒张。有研究报道NE激活血管中的α-AR,使血压升高加重心脏后负荷,通过心脏氧化应激产生ROS介导心脏炎症[20],而哌唑嗪可以减轻NE诱导的心脏炎症。但是关于哌唑嗪是否会缓解病理性心脏室性心律失常,尚无相关报道,因此本研究用α1-AR拮抗剂哌唑嗪处理NE诱导的室性心律失常大鼠后发现,由NE诱导的血压升高作用受到了显著抑制,且大鼠室性心律也在α1-AR拮抗剂使用后有所改善。在本研究中,使用α1-AR拮抗剂后,大鼠中磷酸化的ERK1/2蛋白与未用拮抗剂处理的NE组相比显著下调,由此表明α1-AR在NE诱导的大鼠室性心率失常中具有重要的调节作用,且ERK1/2信号通路的激活也受到α1-AR的调节。

本研究从动物模型水平研究了α1-AR在NE诱导的大鼠室性心率失常中的作用,这为临床上探究α1-AR作为治疗心律失常的可能靶点提供了一定的基础,但是本研究仍存在局限性,其一是缺乏细胞水平的证据,特别是α1-AR在心肌细胞生理层面的影响作用,其二本研究尚未过多的关注室性心率失常模型大鼠心脏炎症等病理生理变化。这些局限性也是本课题接下来所需要进行的研究方向。

综上所述,NE可以引起大鼠血浆NE水平短暂而迅速的升高、室性心率失常也随之加剧,α1-AR在NE诱导的大鼠室性心率失常中具有重要的调节作用,且α1-AR会激活ERK1/2信号途径,从而对室性心律失常的大鼠起到调节作用。