miR-6819-3p及其IL-17信号通路中靶基因在斑秃病变部位的表达

赵 鹏,李鹏飞,秦俊霞,张馨中,秦小卫*

(1山西省人民医院皮肤性病科,太原 030012;2山西医科大学转化医学研究中心;*通讯作者,E-mail:pfkzhaopeng@163.com)

斑秃(alopecia areata,AA)是一种高度流行的慢性复发性自身免疫性疾病,其特点是头皮或身体其他部位突然出现脱发斑[1,2],在一般人群中的终生风险估计为1.7%-3.8%[3]。AA可发生于任何年龄,尤其好发于青少年,一般轻者的愈合较好,其中约50%病例有复发,特别是初发于儿童者其复发较多,而全秃发生于儿童者时则很难恢复[4]。AA也是一种具有高度情感影响的疾病,对患者心理健康的影响也非常严重,能够降低患者及其家属的生活质量[5-7]。虽然近年来我们对AA在病理生物学的研究上取得了很大进展,但对其还并不完全了解,也没有针对AA的有效治疗方法[8,9]。因此,我们需要更好地对AA的发病机制进行了解。研究显示AA患者病变部位和血清中的IL-17在AA患者表达明显高于对照组[10,11],表明IL-17信号通路在斑秃的病变过程中起着一定作用;而miR-6819-3p在AA患者的血清中表达降低[12],提示其的表达变化会对AA的发病产生影响。就此,本实验拟对AA患者病变部位miR-6819-3p及其靶基因的表达情况以及与IL-17信号通路的关系进行研究。

1 研究对象和方法

1.1 研究对象和试剂

研究分为斑秃组与正常对照组,其中斑秃组为2020年6-12月于山西省人民医院皮肤性病科诊疗的斑秃患者,共20例,入组标准:①依据病史、临床表现及辅助检查确诊为斑秃;②初次就诊,未接受过药物治疗。排除标准:①取材部位有皮肤感染患者;②全秃或普秃患者。正常对照组来自10例本科室外科手术所获得的正常头皮组织。取材尺寸约为1 cm×1 cm。本研究经过山西省人民医院伦理委员会批准,所有受试者均已告知本研究目的及内容并签署知情同意书。

1.2 miR-6819-3p及其靶基因的生物信息学分析

利用miRWalk[13]网站获取miR-6819-3p的预测靶基因,并通过Metascape[14]网站筛选其中与IL-17信号通路相关的靶基因,并利用ViennaRNA软件包[15]中的RNAduplex程序分析miR-6819-3p与其预测靶基因的作用位点,之后用KEGG[16,17]网站的Color Pathway工具及STRING[18]数据库(http://STRING-db.org/)来分析这些靶基因在IL-17信号通路中的位置和相互作用关系。

1.3 荧光定量PCR检测

按照TRIzol试剂说明书,分别对斑秃组和正常对照组的总RNA进行提取。利用RTase M-MLV进行逆转录反应,获得各组相应的cDNA,引物序列见表1。

表1 基因引物序列

1.4 统计学分析

应用SPSS 19.0软件,采用独立样本t检验来比较组间差异,P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 miR-6819-3p与其靶基因的预测结合位点

利用miRWalk网站和ViennaRNA软件包中的RNAduplex程序分析,获得了miR-6819-3p与的CSF3、CXCL8、FOS、FOSB、JUN和NFKBIA等基因的预测结合位点,结果见图1,提示这些基因是miR-6819-3p的靶基因。

图1 miR-6819-3p与IL-17信号通路基因间的预测结合位点Figure 1 Predicted binding sites between miR-6819-3p and its target genes in IL-17 signaling pathway

2.2 斑秃患者病变部位miR-6819-3p及其IL-17信号通路中靶基因的表达情况

荧光定量PCR结果显示,与对照组相比,miR-6819-3p在斑秃患者病变部位的表达量降低,是正常组织的0.057 2,差异有统计学意义(P<0.05);CSF3、CXCL8、FOS、FOSB、JUN和NFKBIA等基因在斑秃患者病变部位的表达量均呈现不同程度的增加,差异均有统计学意义(P<0.05,见图2)。miR-6819-3p与CSF3、CXCL8、FOS、FOSB、JUN和NFKBIA等基因的表达情况相反,提示miR-6819-3p对这些基因可能具有调控作用。

与正常组比较，*P<0.05图2 斑秃患者病变部位miR-6819-3p及其IL-17信号通路中靶基因的表达情况Figure 2 Expression of mir-6819-3p and its target genes in IL-17 signaling pathway in alopecia areata lesions

2.3 miR-6819-3p预测靶基因在IL-17信号通路中的分布及相互作用关系

利用KEGG网站的Color Pathway工具对CSF3、CXCL8、FOS、FOSB、JUN和NFKBIA等基因在IL-17信号通路中的位置进行了标识,结果显示这些靶基因均属于IL-17信号通路(见图3),是IL-17发挥作用的下游关键基因。

图3 KEGG网站Color Pathway工具对miR-6819-3p预测靶基因在IL-17信号通路中的位置标识图Figure 3 The location of miR-6819-3p predicted target genes in IL-17 signaling pathway used by Color Pathway of KEGG

利用STRING数据库对miR-6819-3p预测靶基因间的相互作用分析显示,这些基因间存在着密切的相互作用关系(见图4)。

图4 STRING数据库对miR-6819-3p预测靶基因间蛋白互作分析Figure 4 The protein interactions between miR-6819-3p predicted target genes by STRING database

3 讨论

目前国内外多数学者认为AA是一种T淋巴细胞介导的自身免疫性疾病,近年对AA的研究也主要集中在细胞免疫与AA发病的关系方面。已有研究发现AA皮损毛囊周围浸润的T淋巴细胞及细胞因子在AA发病中起着重要的作用。Th17细胞是一种近年新发现的CD4+T细胞亚群,是一种新型的CD4+效应T细胞,在炎症性疾病及自身免疫病的发病机制中发挥重要的免疫调节作用[19]。国外学者研究发现在AA患者的头皮中,特别是在毛囊周围,有Th17细胞浸润[20],IL-17A较对照组升高[21,22],AA患者外周血Thl7细胞比例较健康对照显著升高[23],且AA活动期组外周血清IL-17水平明显高于稳定期组和正常对照组[24],儿童AA患者外周血与健康儿童比较,外周血Th17细胞比例、IL-17水平增高[25],这些均表明IL-17信号通路可能参与了AA的发病机制。

有研究发现,miR-6819-3p在AA患者的血清中表达降低[12],我们的研究也表明,在AA病变部位miR-6819-3p的表达较正常组降低,提示其表达降低在AA的发病过程中起着一定作用。进一步生物信息学的研究发现,CSF3、CXCL8、FOS、FOSB、JUN和NFKBIA等为miR-6819-3p的预测靶基因,且这些基因均属于IL-17信号通路。我们的实验同时也证实CSF3、CXCL8、FOS、FOSB、JUN和NFKBIA在AA病变部位的表达增加,与miR-6819-3p的表达情况相反,提示miR-6819-3p对这些基因可能具有调控作用,CSF3、CXCL8、FOS、FOSB、JUN和NFKBIA在AA病变部位表达的增加可能是miR-6819-3p表达降低的结果。

研究显示,FOS、FOSB、JUN编码的蛋白质是AP-1转录因子亚单位[26,27],而IL-17以AP-1依赖的方式通过p38/c-Fos和JNK/c-Jun激活炎症反应[28],并能刺激产生CXCL8[29,30]和CSF3[31],促进NFKBIA的表达[32]。这些均表明IL-17与miR-6819-3p这些预测靶基因间存在着密切的调控关系,且这些基因都在IL-17信号通路的下游,因此miR-6819-3p可以通过对这些靶基因以及IL-17信号通路的调控在AA的发病中发挥作用。

AA是一种身体局部出现的病症,病变部位基因表达的变化更能直观地反应疾病发生的机制,同时可以根据这些改变进行局部的针对性治疗,应较全身用药更加安全有效。本研究首次为miR-6819-3p及其预测靶基因在AA发病机制中的功能作用提供了证据,并提示这些基因可以成为AA诊断和治疗中的生物靶标。在下一步的研究中,我们将采用双荧光素酶报告基因检测技术等方法进一步对miR-6819-3p的靶基因进行筛选验证。