槐米黄酮的纯化和体外抗氧化活性研究

王菲，王晨，朱风仪，由佳湄，姚玲珑，孙玉琪，王战勇

(辽宁石油化工大学 石油化工学院，辽宁 抚顺 113001)

槐米，别名白槐、槐籽、槐花米，是豆科植物槐的花蕾，在山东、河南、安徽、山西、陕西等地大量生产。槐米中黄酮含量较为丰富，其所含芸香苷具有降低毛细血管通透性，减轻脆性以及维护血管抵抗力等作用[1-3]。此外，黄酮还具有抗氧化、抗菌消炎、抗肿瘤、增免等生物活性，研究发现，黄酮类化合物具有治疗人体疾病的药理作用[4-8]，功能强大，是一种天然健康安全的保健成分。

近年来，对黄酮类化合的研究越来越受到科技工作者的重视，继而开发了大量的黄酮保健品及药品，迎合了不同人群的消费需求。不同来源黄酮会呈现各自特有的生物活性，本研究选取了资源丰富、黄酮含量较高的，但研究较少的槐米为原料，通过对槐米黄酮进行聚酰胺柱层析纯化处理，研究槐米黄酮纯化物的生物活性，为其后续深入开发利用提供科学理论基础。

1 实验部分

1.1 材料与仪器

槐米，辽宁恒生实业集团有限公司；芦丁标准品(100 mg)，色谱纯；95%乙醇、盐酸、过氧化氢、氢氧化钠、水杨酸、三氯乙酸、硝酸铝、亚硝酸钠、抗坏血酸、邻苯三酚、三羟基氨基甲烷、硫酸亚铁、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠均为分析纯；DPPH，生物试剂；聚酰胺(30～60目)。

ALC-1100.2电子天平；All basic分析研磨机； UV-2600可见分光光度计；RE-52AA型旋转蒸发器；DUG-9021A电热恒温干燥箱；HH-4数显恒温水浴锅；SHB-Ⅲ型循环水式多用真空泵；LGJ-10型冷冻干燥机；TDL-40B台式离心机；DHL-A电脑恒流泵；BS-100A型自动部分收集器。

1.2 槐米总黄酮的提取纯化

槐米于50 ℃干燥至恒重，冷却，粉碎，过40目筛，装瓶待用。

称取一定质量槐米粉末，加入一定量乙醇溶液和一定浓度的SDS，摇匀，经过400 W超声处理、水浴一定时间，离心，上清即为槐米黄酮粗提液。配制一定质量浓度和pH的槐米黄酮上样液，控制吸附流速和上样量进行上样，用蒸馏水淋洗，再用一定浓度、体积的乙醇按照一定流速进行解吸，得到黄酮纯化液，用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH法测定黄酮含量[9]。标准曲线方程为：Y=0.553 4C-0.001 6，R2=0.999 9。 黄酮得率按下面公式计算：

槐米黄酮得率(mg/g干重)=

1.3 槐米黄酮体外抗氧化活性实验

1.3.1 清除DPPH自由基能力的测定 0.2 mmol/L的DPPH 2 mL，加入槐米黄酮纯化液1 mL，加95%乙醇补至4 mL，混匀静置。在517 nm波长，以水为参比，测量95%乙醇吸光度为Ac，样品吸光度为AS[10]。

选择抗氧化能力较好的Vc作阳性对照，以期对比槐米黄酮的体外抗氧化活性，计算黄酮与Vc的清除率。

清除率/%=[(Ac-As)/Ac]×100

清除率/%=[(Ac-As)/Ac]×100

1.3.3 清除羟基自由基(·OH)能力的测定 取1 mL不同浓度槐米黄酮纯化液，分别添加1 mL 10 mmol/L FeSO4，1 mL 10 mmol/L 水杨酸-乙醇，加1 mL 8.8 mmol/L H2O2启动反应，37 ℃恒温水浴锅中反应0.5 h。以去离子水作参比，在510 nm处测定1 mL去离子水AC和样品AS[12]。Vc为阳性对照计算清除率。

清除率/%=[(Ac-As)/Ac]×100

1.3.4 还原力的测定 取1 mL不同浓度槐米黄酮纯化液，依次加入pH 6.6 0.2 mol/L磷酸缓冲液和1% K3Fe(CN)6各2.5 mL混匀，于55 ℃保存20 min，取出，迅速冷却，加入10%三氯乙酸2.5 mL混合，3 000 r/min离心10 min，取2.5 mL上清液，加水2.5 mL、0.1% FeCl30.5 mL，充分混合后静置10 min。以去离子水作参比，于700 nm测定1 mL去离子水Ac和样品AS[13]。Vc为阳性对照计算还原力。

还原力=As-Ac

2 结果与讨论

2.1 槐米黄酮纯化条件研究

2.1.1 pH的影响 称取0.5 g的干聚酰胺树脂8份，分别放入100 mL三角瓶中，用少量去离子水浸泡4 h，使其达到饱和，滤掉多余水分，分别加入pH值为1.86,2.73,3.89,4.78,5.63,6.89,7.42,8.56，质量浓度为5.22 mg/mL上样液40 mL，于室温下振荡吸附24 h，使其完全均衡，并计算相应吸附量(Q),结果见图1。

由图1可知，在pH 6.89时，聚酰胺对黄酮吸附量最大，即在pH 6～7之间有较大的吸附效果。这是由于黄酮具有多羟基酚和糖苷键结构，使其显弱酸性，所以在弱酸性环境中吸附良好。因此，上样液pH控制在6～7较为合适。

2.1.2 上样液质量浓度的影响 用相同方法处理7份树脂，将40 mL、pH 6.0、浓度分别为1.33，2.66，3.99，5.22，6.65，7.98，9.31 mg/mL的样品液分别加入7份树脂中，操作同上，计算吸附量(Q)，结果见图2。

由图2可知，吸附率随黄酮质量浓度的增加先增大后减小，在5 mg/mL左右时吸附率最大，故选择5 mg/mL为最适上样液质量浓度。

2.1.3 吸附流速的影响 将pH 6.0,5.22 mg/mL上样液按不同吸附流速0.5，1，1.5，2，2.5，3，3.5，4 mL/min上样，分别计算吸附率，结果见图3。

由图3可知，最大吸附率出现在1.0 mL/min处，之后流速过快，导致吸附不充分，吸附率下降。因此，选择1.0 mL/min为最佳吸附流速。

2.1.4 上样量的影响 将pH 6.0,5.22 mg/mL上样液按柱床体积倍数1，2，3，4，5 BV进行上样，吸附流速1.0 mL/min，分管收集流出液，测定其中黄酮浓度，计算聚酰胺对槐米黄酮的吸附率，结果见图4。

一般来说，最适上样量出现在流出液中黄酮质量浓度为上样液中的1/10时，此时停止继续上样。由图4可知，最佳上样量为1.5 BV。

2.1.5 冲洗水量的影响 将pH 6.0,5.22 mg/mL上样液按1 mL/min进行上样，用1 BV蒸馏水淋洗，共5次，按柱体积分别收集淋洗流出液，测定其中黄酮的残留量，结果见图5。

由图5可知，冲洗水量超过3 BV时，流出液基本无色。因此，选择3 BV冲洗水量最为合适。

2.1.6 解吸液浓度的影响 将pH 6.0,5.22 mg/mL上样液按1 mL/min上样，用3 BV蒸馏水淋洗聚酰胺柱，再用体积分数分别30%，40%，50%，60%，70%，80%，90%，100%乙醇溶液进行洗脱。根据各阶段解吸液中黄酮含量，计算相应解吸率，结果见图6。

由图6可知，乙醇体积分数80%时解吸率最大。因此，解吸液浓度80%较为合适。

2.1.7 解吸流速的影响 将pH 6.0,5.22 mg/mL上样液按1 mL/min上样，3 BV蒸馏水淋洗聚酰胺柱，再用体积分数80%乙醇分别在1，1.5，2，2.5，3，3.5，4，4.5 mL/min解吸流速下洗脱，收集解吸液，并测定黄酮含量，算出相应解吸率，结果见图7。

由图7可知，解吸流速增大，解吸率先升高后下降，在1.5 mL/min达到最大，故解吸流速以1.5 mL/min 较为适合。

2.1.8 解吸液用量的影响 将pH 6.0,5.22 mg/mL上样液按1 mL/min上样，3 BV蒸馏水淋洗聚酰胺柱，再分别用0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，3.5，4.0，4.5，5.0，5.5，6.0，6.5，7.0，7.5 BV，80%乙醇按1.5 mL/min进行解吸，分别收集解吸液，测定黄酮含量，结果见图8。

由图8可知，当解吸液超过4 BV时，流出液中黄酮浓度显著减少，说明已基本洗脱完全。故为减少溶剂浪费，解吸液用量选择4 BV较合适。

2.1.9 聚酰胺柱使用次数的影响 在一根聚酰胺树脂柱上进行吸附解吸实验，计算每一次的黄酮吸附率，结果见图9。

由图9可知，增加使用次数，吸附效果逐渐变差。这与杂质堵塞树脂孔隙有关。当使用次数增加到6次后，吸附率下降趋势尤为明显。因此，聚酰胺柱每用5次就需要再生。

2.2 槐米总黄酮的体外抗氧化实验

2.2.1 对·DPPH的清除力 由图10可知，槐米黄酮对·DPPH清除效果较Vc略差，但是相较而言，槐米黄酮在600 μg/mL高浓度区间内，对·DPPH 达到了87.14%的清除率，也表现出了对·DPPH 较强的清除效果，但比Vc略差一些。

2.2.3 对·OH的清除力 由图12可知，Vc对·OH 清除率在1 000 μg/mL时达到了98.92%，效果非常好。与Vc相比较，槐米黄酮在1 000 μg/mL时只有34.57%，仅表现出一定的清除力，效果比Vc差些。

2.2.4 还原力 吸光度越大，表明还原能力越强。由图13可知，槐米黄酮的还原能力与Vc接近。

3 结论

(1)槐米黄酮最佳纯化条件：用5 mg/mL，pH 6～7的槐米黄酮液按吸附流速1.0 mL/min上样1.5 BV，用3 BV水淋洗，再用5 BV 体积分数80%乙醇，按1.5 mL/min解吸，效果最佳，树脂每使用5次后再生。