肝内胆管癌中ANXA9的表达及其对细胞侵袭的影响

李凡妮，张 磊，于田雨，佘军军，孙 祺

肝内胆管癌(intrahepatic cholangiocarcinoma, iCCA)起源于肝内胆管上皮，是常见的肝脏恶性肿瘤，占肝脏原发恶性肿瘤的5%～30%[1]。由于早期临床症状不典型以及进展快速的特性，大多数iCCA患者在初诊时通常已失去根治性手术机会，放、化疗等辅助治疗的效果也并不理想[2-3]。iCCA患者预后较差，即使是接受根治性切除术的iCCA患者，其5年总生存率仍低于40%[4]。目前，针对iCCA的个性化治疗尚缺乏有效的靶向治疗[5]。因此，明确iCCA发生、发展的机制，并寻找有效的分子靶点对iCCA的治疗尤为重要。ANXA9是膜联蛋白家族ANXA亚组中的一员，其在肿瘤的进展过程中发挥重要作用。已有文献报道ANXA9在胃癌组织中高表达，其与组织分化程度和预后有关[6]，并且能促进结肠癌细胞的增殖[7]，但ANXA9与iCCA的相关性尚未见报道。本文着重探讨ANXA9在iCCA中的表达，并通过干预ANXA9的表达及细胞功能学实验进一步明确其对iCCA侵袭的影响，以期为iCCA的治疗靶点提供参考。

1 材料与方法

1.1 临床资料收集2020年6～9月西安交通大学第一附属医院接受根治性切除术的12例iCCA患者的新鲜癌组织及相应的癌旁正常组织。另收集67例行根治性切除术患者的iCCA蜡块并制备成组织切片。本实验经我院伦理委员会批准，患者均知情同意。

1.2 细胞株人iCCA细胞株HuCCT1，购自武汉普诺赛公司。

1.3 方法

1.3.1免疫组化 石蜡切片脱蜡水化后，使用柠檬酸盐缓冲液(pH 6.0)结合微波进行表位抗原修复，用3%过氧化氢处理30 min，以淬灭内源性过氧化物酶活性。用10%正常山羊血清处理30 min，与抗人ANXA9的小鼠单克隆抗体(sc-374288，Santa Cruz公司)在4 ℃孵育过夜，与抗小鼠二抗孵育30 min，通过DAB(上海碧云天公司)进行免疫组化SP法染色，苏木精复染，脱水封固。

1.3.2qRT-PCR检测 通过RNeasy试剂盒(Qiagen公司)提取组织或细胞的总RNA，应用SuperScript First Strand cDNA试剂盒(Invitrogen公司)进行反转录，使用SYBR Green和LightCycler 480 PCR系统(Roche公司)进行相对定量分析。ANXA9的引物序列：正向5′-CAGCTCATCTCACGAAACTTCC-3′，反向5′-GGTTCGAGTGGCAAGAATTTCAA-3′；β-actin内参基因引物序列：正向5′-CATGTACGTTGCTATCCAG GC-3′，反向5′-CTCCTTAATGTCACGCACGAT-3′。3次独立实验的数据结果采用2-△△CT法进行分析。

1.3.3细胞培养和siRNA转染 将处于对数生长期的HuCCT1细胞在含有10%胎牛血清(Gibco公司)、1%青霉素-链霉素双抗混合液(上海碧云天公司)的RPMI 1640(Thermo Fisher公司)中培养。通过Lipofectamine 3000(Invitrogen公司)将靶向ANXA9的siRNA转染HuCCT1细胞。ANXA9 siRNA的序列：5′-GCAGUCUACAAACACAAUU-3′，由上海生工公司合成。

1.3.4Transwell实验 使用预先包被Matrigel(Thermo Fisher公司)、孔径为8 μm的Transwell小室(Corning公司)进行侵袭实验。使用无血清培养基将1×105个HuCCT1细胞接种至上室，下室用完全培养基进行培养。24 h后，用棉签除去上层未侵袭的细胞，然后进行固定和染色，在4个随机视野(400×)对侵袭的细胞进行计数。

1.3.5Western blot法 使用含有蛋白酶抑制剂的RIPA缓冲液裂解细胞，通过Bio-Rad BCA蛋白质测定法确定蛋白浓度后，将等量的蛋白在SDS-PAGE中电泳分离并转移至PVDF膜，封闭后与ANXA9抗体4 ℃孵育过夜，通过ECL化学发光液(Thermo Fisher公司)进行显影。以β-actin作为内参。

1.4 统计学分析使用SPSS 18.0软件进行统计学分析。通过χ2检验比较ANXA9的表达与临床病理特征的关系，采用t检验进行两样本均数的比较，通过方差分析进行多个样本均数的比较，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 iCCA和癌旁组织中ANXA9的表达采用qRT-PCR对12例iCCA组织及癌旁正常组织中ANXA9的mRNA水平进行检测，结果显示iCCA组织中ANXA9 mRNA的转录水平显著增加,差异有统计学意义(P<0.01，图1)。

图1 肝内胆管癌组织及癌旁正常组织中ANXA9 mRNA的相对表达量：与癌旁正常组织相比，**P<0.01

2.2 iCCA中ANXA9的表达与临床病理特征的关系采用免疫组化检测67例iCCA组织中ANXA9的表达，发现ANXA9表达主要定位于细胞膜和细胞质，呈浅～棕黄染色；iCCA组织中有39例(58.2%)ANXA9呈阳性(图2A)，28例(41.8%)呈阴性(图2B)。ANXA9的表达与淋巴结转移、TNM分期密切相关(表1)。有淋巴结转移、TNM分期越高者，ANXA9的表达水平越高(P<0.05)。

图2 A.肝内胆管癌组织中ANXA9呈阳性；B.肝内胆管癌组织中ANXA9呈阴性，SP法

表1 肝内胆管癌中ANXA9表达与临床病理特征的关系

2.3 siRNA对HuCCT1细胞中ANXA9基因表达的影响为验证siRNA对ANXA9的沉默效应，本组对HuCCT1细胞转染靶向ANXA9的siRNA后，发现ANXA9基因的表达水平下调。qRT-PCR实验结果显示，siRNA实验组与对照组相比，其细胞ANXA9的转录水平降低(P<0.05)，提示干扰成功，本组siRNA能够抑制ANXA9基因的表达(图3)。

图3 转染siRNA后，HuCCT1细胞中ANXA9 mRNA的表达：与对照组相比，*P<0.05

2.4 Transwell实验检测沉默ANXA9对细胞侵袭的影响通过Transwell侵袭实验比较ANXA9 siRNA实验组与对照组细胞的侵袭能力，结果显示：培养24 h后对照组可见多量癌细胞侵袭，每视野为(72±6)个细胞，而ANXA9 siRNA实验组癌细胞的侵袭数目明显减少，每视野为(37±4)个细胞，两组相比差异有统计学意义(P<0.05)，提示与对照组相比，实验组siRNA沉默ANXA9的表达后，HuCCT1细胞的侵袭能力明显降低(图4)。

图4 Transwell实验检测沉默ANXA9对HuCCT1细胞侵袭的影响：与对照组相比，*P<0.05

2.5 Western blot法检测沉默ANXA9对MMP-9表达的影响本组Western blot结果显示，在对照组和ANXA9 siRNA实验组均可见MMP-9蛋白的表达；与对照组相比，通过siRNA沉默HuCCT1细胞中ANXA9的表达后，不仅ANXA9的蛋白水平明显下调，而且MMP-9的蛋白表达明显降低，提示ANXA9能够调控HuCCT1细胞中MMP-9的表达(图5)。

图5 Western blot法检测沉默ANXA9对MMP-9表达的影响

3 讨论

膜联蛋白是真核生物细胞中最大类别的钙依赖性磷脂结合蛋白家族，其家族成员包括A、B、C、D和E亚组，在细胞分化和增殖等各种生理过程中发挥重要作用[8]。ANXA亚组包含12个成员[9]，其中许多成员与肿瘤的发展密切相关。袁虎方等[10]发现ANXA7的表达与胃癌患者预后及淋巴结转移有关，且可作为判断胃癌淋巴结转移的预测因素。此外，胃癌患者外周血液中ANXA7的水平能够较好反映其在癌组织中的表达水平，可作为诊断胃癌的辅助指标[11]。ANXA6作为乳腺癌进展的生物学标志物，能够预测乳腺癌的复发及其对表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKI)靶向治疗的反应和疗效，ANXA6表达的上调与获得性EGFR-TKI耐药性有关[12]。ANXA2可能通过增加调节性T细胞的比例并降低天然杀伤细胞和树突状细胞的比例调节免疫微环境，最终促进肝细胞癌的进展[13]。然而，作为膜联蛋白家族的新成员，目前鲜有ANXA9在肿瘤进展中的作用报道，尤其是ANXA9在iCCA中的表达。

本实验结果表明，ANXA9在iCCA组织中高表达，并且与淋巴结转移、TNM分期密切相关。文献报道ANXA9可作为结直肠癌和乳腺癌预后不佳的标志物[14-15]。此外，ANXA9的表达与结肠癌的浸润深度和淋巴结转移相关，并且能够促进结肠癌细胞的上皮-间质转化和侵袭[16]。癌细胞在转移扩散过程中，首先需要通过降解基膜，突破限制其侵袭的天然屏障。IV型胶原是基膜的主要成分，而作为一种常见的锌依赖性蛋白水解酶，MMP-9能够降解IV型胶原，并重塑细胞外基质，从而促进肿瘤的血管生成及转移[17-18]。MMP-9的表达水平与胆管癌等多种恶性肿瘤的淋巴结转移密切相关[19-22]。不同的膜联蛋白与基质金属蛋白酶之间可能存在相关性，据文献报道ANXA7下调通过降低MMP-9的表达抑制胃癌细胞的迁移和侵袭[23]，而ANXA1在弥漫性星形细胞瘤中的表达与MMP-9表达呈正相关[24]。本组体外细胞学实验发现通过siRNA沉默ANXA9的表达能够抑制iCCA细胞的侵袭能力，且伴随MMP-9表达水平的下调，提示ANXA9有可能通过MMP-9调控细胞的侵袭，促进iCCA的进展。

不同的ANXA成员在肿瘤进展过程中发挥不同的作用。在部分类型的肿瘤中，某些ANXA成员的表达呈下调趋势，如ANXA6在胃癌中通过启动子甲基化被下调，其通过抑制MAPK信号通路发挥抑癌作用[25]。ANXA10是肝细胞分化和生长停滞的标志物，ANXA10在肝细胞癌组织中低表达，并随着分期的增加表达下降，其与MMP-9表达呈负相关[26]。ANXA5过表达能够通过调节E-cadherin和MMP-9的表达抑制子宫颈癌细胞的转移[27]，而ANXA1在不同类型的肿瘤中具有不同的促癌或抑癌作用[28]。因此，ANXA在癌症中的不同表达特点与功能具有组织特异性。

ANXA成员中除了本组发现ANXA9与iCCA的进展密切相关以外，ANXA2的表达与肝内胆管结石相关iCCA的恶性程度和预后密切相关[29]。ANXA5能够抑制胆管癌细胞的凋亡，沉默ANXA5的表达可抑制胆管癌细胞的增殖和侵袭[30]。胆管癌中ANXA2表达上调，其可能通过调节上皮-间质转化、细胞外基质降解进而影响疾病转归[31]。Wang等[32]发现ANXA1在肝门部胆管癌中表达降低，且ANXA1表达水平的降低与患者的不良预后相关，提示ANXA1可能在肝门部胆管癌中发挥抑癌作用，提示不同的ANXA成员在胆管癌进展过程中发挥的作用及机制也不完全相同。

综上所述，本实验结果显示ANXA9在iCCA中高表达，并与淋巴结转移及TNM分期相关，其机制可能是ANXA9通过调控MMP-9的表达诱导iCCA细胞的侵袭。本实验揭示了ANXA9在iCCA中的表达及其对iCCA细胞侵袭的影响及可能机制，为iCCA的治疗提供一个新的潜在分子靶点及理论依据。