HE切片经不同方法褪色后行EGFR基因突变检测的对比分析

李钦丽，张继伟

我国肺癌的发病率和病死率呈逐年增加趋势，已位居各类癌症的首位[1]。随着靶向治疗的发展，EGFR突变状态已成为指导晚期肺腺癌治疗的重要指标[2]，其基因状态的检测对靶向药物的选择起到至关重要的作用。但肺癌晚期患者已失去手术机会，只能获取活检样本或胸腹水样本，经常规HE及免疫组化染色，剩余肿瘤组织不足以进行EGFR检测，直接影响患者的后续治疗。本实验通过对HE切片经高锰酸钾草酸和盐酸乙醇两种方法褪色后行EGFR基因突变的检测进行对比，探讨两种方法对HE切片褪色后行EGFR检测的影响，为肿瘤组织不足的肺癌患者后续治疗提供可靠依据。

1 材料与方法

1.1 材料选取EGFR 21号外显子L858R突变阳性的肺腺癌标本3例，每例标本各选取1个蜡块，4 μm厚连续切片6张，分为白片组、高锰酸钾草酸褪色组和盐酸乙醇褪色组，每组切片2张。

1.2 主要试剂及仪器核酸提取试剂盒(FFPE DNA)、人类EGFR基因突变检测试剂盒、SMA4000超微量紫外可见核酸蛋白分析仪，购自厦门艾德公司；Quant Studio 3D Digital PCR Master Mix v2、EGFR Custom TaqMan SNP Genotyping Assays、Quant Studio 3D Digital PCR System，购自赛默飞公司；Mx3000P型荧光定量PCR仪，购自安捷伦公司。

1.3 方法

1.3.1HE染色与褪色 经常规HE染色后，HE切片用烤片机加热，当盖玻片内的中性树胶产生气泡时，将切片置入康莱中浸泡至盖玻片自行脱落。将切片置于新鲜康莱2次，每次5 min，保证洗净中性树胶，梯度乙醇(100%、95%、85%、75%)脱去康莱，用蒸馏水冲洗。(1)将切片放入0.5%高锰酸钾氧化5 min，蒸馏水冲洗干净，2%草酸溶液漂白，待组织完全变白后用蒸馏水冲洗干净，显微镜下观察褪色效果；(2)将切片放入新鲜配置的1%盐酸乙醇15 min，待组织完全变白后用蒸馏水冲洗干净，显微镜下观察褪色效果。

1.3.2DNA提取和定量 按照核酸提取试剂盒的操作方法，提取上述3组样本DNA，并用SMA4000超微量紫外可见核酸蛋白分析仪测量DNA的浓度及纯度。

1.3.3ARMS-PCR扩增和结果判读 取出预分装的PCR反应试剂，按照EGFR检测试剂盒的要求分别加入阴性对照、样本和阳性对照，放入荧光定量PCR仪中进行扩增。扩增条件：95 ℃ 5 min，1个循环；95 ℃ 25 s，64 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，合计15个循环；93 ℃ 25 s，60 ℃ 35 s，72 ℃ 20 s，合计31个循环。60 ℃时收集FAM和HEX信号。PCR扩增结束后，严格按EGFR检测试剂盒的判读要求进行结果判读。

1.3.43D Digital PCR扩增和结果判读 将配制好的反应液装载到芯片上后，进行PCR扩增。3D Digital PCR扩增条件：96 ℃ 10 min，1个循环；60 ℃ 2 min，98 ℃ 30 s，合计39个循环；60 ℃ 2 min，10 ℃保存。PCR反应结束后，读取芯片分析结果，进行数据分析。

2 结果

2.1 DNA的浓度和纯度按核酸提取试剂盒的要求提取DNA，各组样本的DNA最后均用50 μL洗脱液进行洗脱。三组样本DNA的纯度均为1.8～2.0，差异无统计学意义；高锰酸钾草酸褪色组和盐酸乙醇褪色组的DNA浓度均高于白片组，差异有统计学意义(P<0.05，表1)。

表1 DNA浓度和纯度比较

与白片组相比，*P<0.05

2.2 ARMS-PCR检测按照EGFR基因突变检测试剂盒的要求，各组样本DNA浓度均为1.5 ng/μL。白片组的外控和L858R的Ct值分别为18.77±0.14、22.83±0.05，盐酸乙醇褪色组的外控和L858R的Ct值分别为18.39±0.23、21.96±0.07，两者之间差异无统计学意义(图1)，符合试剂盒的结果判读标准，L858R突变阳性。高锰酸钾草酸褪色组的外控和L858R的Ct值分别为23.94±0.38和27.25±0.64，均高于白片组和盐酸乙醇褪色组，差异有统计学意义(P<0.05，图1)，不符合试剂盒的结果判读标准，无法进行结果判读。

图1 ARMS-PCR检测：A.外控扩增曲线；B. EGFR基因L858R突变扩增曲线；黄色.阳性对照；灰色.阴性对照；蓝色.白片组；绿色.盐酸乙醇褪色组；红色.高锰酸钾草酸褪色组

2.3 3D Digital PCR检测本实验用高灵敏度的3D Digital PCR技术进行EGFR基因突变检测，在样本DNA均为10 ng的条件下，高锰酸钾草酸褪色组L858R的突变丰度为(16.28±0.50)% 明显低于白片组(19.93±0.50)%和盐酸乙醇褪色组(19.41±0.36)%，差异有统计学意义(P<0.05，图2)。

图2 3D Digital PCR检测：A.阴性对照组；B.白片组；C.高锰酸钾草酸褪色组；D.盐酸乙醇褪色组；黄色.空白；蓝色.EGFR基因L858R突变型；绿色.EGFR基因L858R突变型+EGFR基因野生型；红色.EGFR野生型

2.4 DNA片段化比较为明确HE切片经高锰酸钾草酸褪色组样本DNA不满足ARMS-PCR检测的需要，本实验利用美国Invivosribe淋巴瘤基因重排检测试剂盒中的size ladder检测各组样本DNA的片段长度，白片组和盐酸乙醇褪色组DNA片段长度主要为100、200、300 bp，而高锰酸钾草酸褪色组DNA片段长度则主要为100 bp(图3)。

图3 DNA片段化检测：M. Marker；S1.白片组；S2.高锰酸钾草酸褪色组；S3.盐酸乙醇褪色组

3 讨论

研究证实，HE切片褪色后除可重新进行HE染色外[3]，还可进行免疫组化[4]、原位杂交[5]、免疫荧光[6]和特殊染色[7]检测。常用的HE切片褪色方法包括高锰酸钾草酸氧化漂白法和盐酸乙醇褪色法[3]。本实验通过对HE切片经上述两种方法褪色提取DNA的浓度和纯度进行比较，发现两组DNA的纯度与白片组相比差异无显著性，但浓度却显著增加，原因可能是两种方法行HE切片褪色时，在导致苏木精和伊红与细胞分离的同时，也改善DNA与蛋白的交联，促进DNA的暴露，进而引起DNA浓度的增加。

本实验对HE切片分别经高锰酸钾草酸和盐酸乙醇两种方法褪色后，通过ARMS-PCR和3D Digital PCR两个平台行EGFR检测。在模板量相同的情况下，与白片组相比高锰酸钾草酸褪色组外控Ct值和L858R突变的Ct值均显著增大，超出结果的判读标准；而盐酸乙醇褪色组外控Ct值和L858R突变的Ct值与白片组相比差异无统计学意义，明确EGFR基因L858R阳性突变。3D Digital PCR结果显示高锰酸钾草酸褪色组EGFR基因L858R突变丰度明显低于白片组和盐酸乙醇褪色组，差异有显著性，而后两组之间差异无显著性。以上结果表明，HE切片经高锰酸钾草酸褪色时，尽管获取的DNA浓度有所增加，但由于高锰酸钾为强氧化剂，在处理过程中可能导致有效DNA含量降低。本实验对三组样本DNA进行片段分析，在PCR扩增模板量均为50 ng的条件下，聚丙烯酰氨凝胶电泳结果显示，高锰酸钾草酸褪色组DNA片段化比较严重，最长片段主要为100 bp，而白片组和盐酸乙醇褪色组最长片段为300 bp以上。以上结果表明，HE切片经高锰酸钾草酸褪色时可加重DNA片段化，最终影响EGFR基因突变的检测，但盐酸乙醇褪色法却不会导致该结果的发生。

综上所述，在样本量不足或进一步获取组织样本受限时，可以用HE切片褪色后行EGFR突变检测，但褪色方法以1%盐酸乙醇褪色法最佳，其与高锰酸钾草酸氧化漂白法相比，在增加样本DNA质量的同时，仍可保持DNA片段的完整性，保证EGFR检测结果的可靠性，有利于非小细胞肺癌患者个体化治疗方案的实施。