基于定量蛋白质组学的结直肠肿瘤脾气虚证患者差异表达蛋白研究

柴仲秋，戴广法，周 冰

（1.天津市滨海新区中医医院肛肠科，天津 300000；2.天津市滨海新区新港街社区卫生服务中心，天津 300000）

结直肠肿瘤（colorectal neoplasms）是世界范围高发病率、高死亡率的消化道系统恶性肿瘤，其发病率居全球恶性肿瘤第3 位，死亡率居第2 位[1]。随着研究的深入，目前已发现肿瘤细胞与基质微环境的相互作用对肿瘤的侵袭、转移和预后影响重大[2]，而这一过程与中医证候的整体观念具有极大的相似性。“证”是对致病因素与机体反应性的综合情况，是对疾病当前本质所作的结论。近年来，针对结直肠肿瘤中医证候本质的研究日益增多，但应用组织进行差异表达蛋白分析的研究相对较少。在辨证基础上对肿瘤组织和正常组织的差异表达蛋白进行筛选可能对结直肠肿瘤的疾病发展、治疗和转归提供新的研究方向。本研究在前期调查中发现脾气虚证是结直肠肿瘤的常见证候之一[3]，因此以脾气虚患者为研究对象开展相关研究，探索结直肠肿瘤脾气虚证患者肿瘤组织与正常组织的差异表达蛋白，寻找该证型的中医治疗靶点。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2012 年8 月-2019 年8 月因结直肠肿瘤就诊于天津市滨海新区中医医院行手术治疗的患者作为研究对象。参照中华中医药学会中医肛肠科常见病诊疗指南[4]、Dukes 分期及AJCC/UICC TNM 分期标准进行病情分期判定。参照证素诊断标准[3]，对每位患者的四诊信息进行归类整理和证候判定。证候诊断为脾气虚证的患者共38 例，其中男21例，女17 例，年龄48～65 岁，平均年龄（55.16±13.15）岁；TNM 分期：Ⅰ期20 例、Ⅱ期11 例、Ⅲ期7 例，病理大体分型：隆起型6 例、溃疡型8 例、隆起溃疡型18 例、浸润型6 例；病理类型腺癌31 例、黏液腺癌4 例、印戒细胞癌1 例、腺癌并印戒细胞癌2 例。

1.2 方法 手术切除肿瘤后分别取患者癌灶肠管组织及远端正常肠管组织，各2 份，立即置液氮冻存。将样本用液氮预冷的砸碎器砸碎，液氮研磨，提取蛋白同时进行分组标记（肿瘤组织标记为113，正常组织标记为114）。BSA 法定量检测蛋白质水平；在高pH条件下进行反相色谱分离后的得到的组分采取夹心法上Loading Pump 以流速3 μl/min 进行分离。设置质谱参数后，进行质谱分析。根据蛋白的定量信息，选取上下调差异倍数≥1.4 的蛋白作为差异蛋白。

1.3 生物信息解析 将差异表达的蛋白输入Uniprot数据库进行功能和基因检索，将对应基因保存为TXT 文件，输入到Metascape，选择选择H.Sapiens，然后选择Express Analysis，自动生成对差异表达蛋白进行的通路富集和分析结果。

2 结果

2.1 差异表达蛋白 脾气虚证肿瘤组织与正常组织中差异蛋白总数为140 个，其中上调71 个，下调69个。进一步筛选上下调差异倍数≥1.6 倍的差异蛋白总数为42 个，其中上调蛋白20 个，见表1，下调蛋白22 个，见表2。

表1 脾气虚证肿瘤组织与正常组织比较上调的蛋白

表2 脾气虚证肿瘤组织与正常组织比较下调的蛋白

表2 （续）

2.2 差异表达蛋白分析 应用Metascape 对上下调差异倍数≥1.4 倍的140 个差异蛋白进行通路富集，其中排名前20 的通路见表3 和图1；主要生物过程见图2，主要集中在平滑肌收缩、气体运输、粒细胞激活、Nop56p-associated pre-rRNA 复合体、血管平滑肌收缩、防御反应的积极调节、RNA 代谢等。

图1 差异表达蛋白的通路富集（TOP 20）

图2 差异表达蛋白的主要生物过程

表3 差异表达蛋白的通路富集

3 讨论

近年来，整体观念指导下的中医辨证论治逐渐成为结直肠癌治疗方案中不可忽视的一环，其积极作用也日益显现。然而由于缺乏客观、稳定的诊断及疗效评价指标，中医证候的辨识模糊且不稳定。辨证论治是中医临床医学的精髓，证候是中医立法处方的依据。因此，在整个中医药理论体系的框架内，中医的证候问题始终处于核心的地位，它是连接临床和基础理论的桥梁，也是中医药理论现代化能够取得突破的关键点。近年来众多学者开展了结直肠癌中医证候规范化及证候间差异表达因子的研究，为结直肠癌中医证候客观化奠定了基础，提供了有益的研究方向。

王洪琦等[5]采用免疫组化法、ELISA 法和RTPCR 法对肿瘤组织中HSP70 和P53 进行比较，发现结肠癌热证组、热证合计组HSP70、P53 的阳性率均明显高于各非热证组。杜国亮等[6]采用免疫组化法对肿瘤组织蛋白P21WAF1 和p21H-ras 进行分析，发现虚证组p21WAFl 阳性表达水平显著低于实证及虚实夹杂证组。吴苏冬等[7]应用免疫组化法对肿瘤组织蛋白p53、Bcl-2 和Bax 进行分析发现，脾虚组患者p53，Bcl-2 蛋白的阳性表达率及表达水平显著高于非脾虚组。罗明等[8]采用免疫组化法对肿瘤组织CD44v6 及PCNA 进行分析，发现有淋巴结转移或全身多处转移结直肠癌患者，实证较虚证CD44v6 的表达明显增高。周小军等[9-11]采用通过双向凝胶电泳的方法对肿瘤组织进行蛋白质组学分析，同时联用质谱鉴定和生物信息学分析发现湿热蕴结证、气血亏虚证结直肠癌患者肿瘤组织之间，以及两组患者与正常人结肠黏膜组织间的差异蛋白质主要为热休克蛋白（HSP）、细胞骨架蛋白、抗氧化蛋白、信号转导相关蛋白、能量产生相关蛋白、血液蛋白等。赵海燕等[12]同样通过双向凝胶电泳对肿瘤组织进行蛋白质组学分析，并联合质谱鉴定和生物信息学分析发现血瘀组较健康组和气血亏虚组的IL-8、维生素D 结合蛋白前体、β-GDP 解离抑制因子、α-二酯酰甘油激酶表达均上调，而纤维结合蛋白（FN）均下调；同时，血瘀组较健康组上调而较气血亏虚组下调的为肿瘤基因DJ-1、载脂蛋白A-I 前体、软骨关联性蛋白前体；血瘀组较健康组下调、而较气血亏虚组上调的为ADP 核糖基化类蛋白15、血清淀粉样蛋白A。龚秀丽等[13]通过免疫组化方法对虚实两组证候的正常组织、癌旁组织和肿瘤组织检测α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、成纤维细胞激活蛋白（FAP）、成纤维细胞特异蛋白（S1O0A6）、富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白（SPARC）、平足蛋白podoplanin（PDPN）的表达，发现中医虚实两组的癌组织、癌旁组织和正常组织中上述活化成纤维细胞标记物表达差异不明显。洪朝金等[14]采用人全基因组芯片检测大肠癌组织差异表达基因，筛选并分析阴虚证癌组织组和癌周正常组织组的差异表达基因，并利用Pathway 对相关基因进行生物信息学分析。结果发现大肠癌围手术期患者阴虚证癌组织组和癌周正常组织组表达的差异基因共4869 个，包括上调基因1574 个，下调基因3295 个，主要涉及炎症反应、细胞内吞功能、矿物质吸收、酮体合成与分解功能、免疫功能等相关基因，其主要信号转导通路包括MAPK 信号通路及p53 信号通路等。白玉茹[15]的研究为探寻脾虚湿盛型大肠癌的客观依据，其选取23 例经病理确诊的脾虚湿盛型大肠癌患者的组织进行iTRAQ 定量蛋白鉴定并进行生信分析和WB验证。结果显示MGST2、RRM2、SRM、GSTT1、GPX3、GSTM3 6 个差异蛋白经WB 验证与iTRAQ结果一致，为脾虚湿盛型大肠癌的发生发展机制及相关肿瘤标志物的研究提供了新的线索。季青等[16]的研究显示，肝肾阴虚证和无证可辨的大肠癌、肝癌患者的血浆蛋白中共同的差异蛋白有8 个，主要与补体和凝血级联途径有紧密联系，认为KNG1、HBA2 等蛋白可能是大肠癌和肝癌“异病同证”的物质基础之一。

本研究发现，脾气虚证结直肠肿瘤组织与正常组织中差异表达蛋白的通路主要集中在平滑肌收缩、气体运输、粒细胞激活、Nop56p-associated prerRNA 复合体、血管平滑肌收缩、防御反应的积极调节、RNA 代谢、Vesicle-mediated 转运、Wnt 信号通路、平面细胞极性通路、DNA 代谢过程的负调控、核导入、突触传递的正调控、线粒体组织、中间丝状细胞骨架组织、胶原蛋白生物合成过程、锌离子反应、调节白细胞介素-12 的产生、细胞生长、生长因子受体和第二信使信号转导疾病、通过受体酪氨酸激酶信号传导等中。蛋白组学技术在传统中医药研究中的应用[17]是现有研究手段中的热点，但由于蛋白组技术的复杂程度更高，涉及到复杂的分离、扩增、纯化和翻译后修饰，因此迫切依托高通量、高灵敏度、高准确性的研究技术平台来开展高水平研究。但随着蛋白芯片、双向电泳、蛋白质谱等技术的不断成熟与使用，蛋白组学技术将在阐明中医药防治大肠癌机制上发挥重要作用。除蛋白组学外，研究者还尝试应用代谢组学[18-20]、网络生物学[21]、系统生物学[22，23]、表观遗传学[24]以及基因多态性[25]等方法来尝试研究中医证候本质，为该领域研究的深入提供了更多的研究方向。

综上所述，脾气虚证结直肠肿瘤患者肿瘤组织与正常组织间的蛋白表达存在差异，其差异蛋白的生物过程主要集中在平滑肌收缩、气体运输、粒细胞激活等通路中，这些通路对脾气虚证的结直肠肿瘤的形成具有重要影响。