新型冠状病毒核酸混采对检测结果的影响

李静静

摘要：目的：探讨2019新型冠状病毒（2019-nCoV）核酸样本采集对提取、扩增步骤的具体影响。方法：选取10只阴性咽拭子保存在含有新冠病毒的样本中，将其按照1：2、1：10的的稀释方式进行稀释，后在稀释样本中加入新型冠状病毒培养液，进行观察检测。选取三种不同的提取方式和体系针对核酸提取试剂及A-E 5 种模板上样量和检测灵敏度不同的扩增试剂分别进行提取和扩增。结果：选择同一种模拟混合样本检测试剂和核酸的影响作用并不大，混采能够提升拭子样本的准确性。结论：核酸混采对检测结果有一定的影响作用，取样检测增加的同时对于检测试剂的添加也应当随之进行，能够帮助提升检测的准确度，降低感染风险的存在。

关键词：新型冠状病毒核酸检测;混采;结果影响

2020年初爆发的新型冠状病毒（2019-nCoV）给全球带来了不可估计的遭难，是一场全球性的集体性爆发的灾情，世界卫生组织（WHO）将将新冠肺炎疫情认定为构成国际公共卫生紧急事件。据新冠疫情爆发至今，世界累计死亡人数已经超过400万，现存确诊人数已经超过2400万以上，给世界公共卫生带来的危害和损失是无法估计的。面对此次巨大的确认和感染人数，快速的进行检测和确诊是当前唯一一个能够快速缓解传染速度的一个重要措施，而核酸检测在检测和预防的过程中起到的作用非常之大，在确定传染源、切断传播途径和保护易感人群方面发挥了重要作用。

但是由于新型冠状病毒的传染速度极快，容易感染的人数可能在一天之内快速蔓延，因此，需要提升检测速度和检测质量，帮助快速查找感染人群，进行几种隔离治疗。对此，我国卫生健康委于2020年8月出台了“新冠病毒核酸10合1混采检测技术规范” ，指将采集自10人的10支拭子集合于1个采集管中进行核酸检测的方法进行检测实验。并且在我国多个高风险地区已经使用该方式对高危人员进行实际筛查和检测。在一些欧美和中东国家实验也取得了相应的成效。新型冠状病毒核酸混采能够帮助快速的提升检测的速度，加快医务人员的工作效率，但是检测结果的影响还有待考察。

为有效判断和检测新型冠状病毒对检测结果的影响，本实验将会采取10只阴性咽拭子保存在含有新冠病毒的样本，按照1：2、1：10的的稀释方式进行稀释，后在稀释样本中加入新型冠状病毒培养液，进行观察检测的方式进行检测，探讨不同检测系统核算灵敏度的影响作用。

一、材料与方法

1.1材料

1.1.1灭活病毒培养液：新型冠状病毒（2019-nCoV）培养液，由我市某科学研究院提供，该培养液已经经过 65 ℃ 热灭活 30 min 处理， 储存于-20 ℃，-20 ℃温度下的2019-nCoV可以用于长期保存。

1.1.2试剂：检测实验所采用的核酸提取方式主要是A、B、C种试剂进行，5 种 2019-nCoV核酸检测试剂。

1.1.3仪器：检测仪器选择美国 企业生产的 QX200 数字 PCR 仪、Pre‑NAT Ⅱ自动核酸纯化仪、扩增仪ABI 7500、国产SLAN荧光定量PCR仪、DNA浓度测定仪为 Merinton微量分光光度计SMA6000，这些仪器的使用能够准确、灵敏的优化检测结果，简便工作流程，同时检测数量也能同时进行高达96个样品检测。

二、方法

2.1灭活病毒培养液定量检测：选择自动核酸纯化仪对病毒进行处理，使用中国疾病预防控制中心发布的针对2019‑nCoV基因组 N 和 ORF1ab 区域的引物和探针进行数字 PCR。热循环条件如下：50 ℃60 min; 95℃10 min;94 ℃30 s循環40次，58 ℃ 45 s，98 ℃ 10 min。

2.2混采对检测结果的影响论证：在以上所使用的仪器当中加入灭活病毒，为了使得检测的结果更具对比性，需要添加10份健康实验者的咽拭子样本进行对比，将其放入采集管当中，均匀摇晃使其混合，以此来获得样本。再将灭活病毒进行1：2和1：10的比例进行混合，以此获得被检测样本。根据规定的定量结果将得到的灭活病毒进行稀释，再用提取剂对其进行样本提取，提取的结果进行三次以上的实验论证，最终得出结论。

2.3混采对扩增影响的验证：在实验采集管中加入6mlVTM，再添加10份健康实验者的咽拭子样本进行充分融合，以此作为阴性拭子的检测样本。将灭活病毒培养液使用 VTM 稀释至终浓度为5000 和 1000 拷贝/ml。使用核酸试剂盒分别提取核酸和病毒核酸，使其变成等量体积。针对不同试剂盒当中的试剂检测混合物进行混合，比较混采样本中不同数量拭子的核酸对检测试剂所产生的影响，以上步骤可以重复3次以上，使得检验的结果更加准确。

2.4改进提取方法提高混采样本检测灵敏度的验证：按照模拟混采样本制备的流程图进行混合溶液稀释进行处理，提取产物等体积混合与扩增，核酸检测试剂盒中的样本检测同样需要检测3次，检测混采样本的准确度。

三、统计学分析

采用 Excel 2010进行数据处理 ， 采用 SPSS20.0进行统计学分析。计量资料以 xˉ ± s 表示。最终统计学结果显示， P<0.05 有统计学意义。

四、结果

一、混采对检测结果的影响

1.不同提取试剂的提取效率比较：稀释浓度为5000 和 1000 拷贝/ml的灭活病毒培养液选取不同的试剂对其进行混采和提取，根据检测的数值得出试剂A的检测结果明显高出B和C的检测结果。

2.混采对提取效率的影响：通过检测的10份健康实验者的咽拭子和新冠病毒核酸混采的样本提取得知，混采对提取效率有一定的影响，会抑制试剂对病毒核酸的提取效率。

二、混采对扩增的影响

1.混采样本中人基因组 DNA浓度的检测：检测所使用的阴性拭子中核酸浓度会随着提取试剂有一定的变化，基因组DNA浓度为核酸浓度的十分之一左右。

2.混采样本中人基因组DNA对A、B试剂扩增结果的影响：将试剂与核酸混合时，并和核酸的浓度会随着拭子核酸的浓度增加而增加，不同组别之间拭子组间比较差异无统计学意义。由此可以得出混采样本中人基因组DNA对试剂扩增无影响。表1为A、B试剂不同浓度扩增结果Ct值分析

讨论

当前针对核酸检测主要是采取两种方式，一种是直接将采集的拭子成分充分融合到同一个检测试管当中，这种检测方式属于混采模式，另外一种检测方式是针对不同的被检测者，进行单份检测，再将多份样本进行混合， 即混检模式。这两种检测方式的最终目的都是帮助提升检测的效率，并且得出的结果都是较为准确的。但是第二种混检方式在实际操作过程中，会受到检测样本数量的增多而降低检测的准确度。因此，当前医学检测公认的最具检测有效度的检测方式为混采模式，不仅保证了检测的准确性同时还能提升检测的效率。

参考文献

[1]闫颖， 常乐， 姬慧敏，等. 新型冠状病毒核酸混采对检测结果的影响[J]. 中华检验医学杂志， 2021， 44（05）：388-393.

[2]钟慧钰，赵珍珍，宋兴勃，等.新型冠状病毒核酸临床检测要点及经验[J].国际检验医学杂志，2020，（5）.523～526.