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核糖体蛋白RPL22在乳腺癌中的表达及临床意义*

2021-09-19朱一春黄智奇施靖天顾长江薛旦旦张春辉

交通医学 2021年4期
关键词:核糖体阴性引物

朱一春,黄智奇,施靖天,顾长江,倪 侃,薛旦旦,张春辉

(1南通大学医学院,江苏 226001;2南通大学附属医院甲乳外科;3南通市第一人民医院甲乳外科)

乳腺癌(breast cancer,BC)是女性常见的恶性肿瘤,严重威胁女性健康[1]。目前乳腺癌的治疗手段多种多样,近年来人们逐渐将目光投向乳腺癌分子靶向领域[2]。核糖体蛋白L22(RPL22)在人体各种细胞中均有表达[3],有研究表明PRL22通过选择性上调抑癌基因p53表达,抑制癌细胞的集落形成,从而发挥抑癌作用[4]。本文选择2015年—2019年于我科行乳腺癌改良根治术患者62例,研究RPL22在乳腺癌组织中的表达情况,并探讨其临床意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料 乳腺癌患者62例,均为女性,平均年龄57.3±11.8岁,中位年龄55.0岁,均未进行术前治疗,且无其他基础疾病。手术获取的乳腺癌组织及癌旁组织各62例标本,-80℃下冻存。本研究经医院伦理委员会批准同意,并获得患者知情同意。

1.2 实验方法

1.2.1 免疫荧光法检测RPL22表达:将石蜡切片在60℃下烤片1 h,随后二甲苯脱蜡10 min。依次加入100%、95%、90%、85%、80%、75%、60%、50%、30%乙醇中进行梯度脱水,自来水冲洗1 min,双氧水冲洗1 min。将切片浸入0.01 mol/L枸橼酸钠缓冲液中,微波最大火力98℃~100℃加热至沸腾,冷却5~10 min,反复2次。冷却至室温后PBS洗涤3次,每次5 min。然后加入5%牛血清白蛋白,室温下封闭20 min,洗去多余液体。滴加按1∶100比例稀释的RPL22抗体进行孵育,4℃过夜。第2天PBS洗涤3次,每次5 min,再滴加二抗室温孵育1 h,PBS洗涤3次,每次5 min。然后加入DAPI液染核及适量抗淬灭剂,盖上盖玻片,镜下观察。

1.2.2 组织RNA提取:将组织标本放入1.5 mL离心管中,加入1 mL TRIzol试剂,研磨器研磨,随后按照说明书步骤提取总RNA。

1.2.3 逆转录反应及qRT-PCR检测RPL22 mRNA表达:使用分光光度计对样品中RNA进行定量,参照cDNA合成试剂盒说明书逆转录生成cDNA,每个样品设置2个重复孔。RPL22上游引物序列为5'-GACAACTGAAAGGGGCTACCAAGG-3',下游引物为5'-GCACCACAAGGCACCAGAGTC-3',GADPH上游引物为5'-CGCTGAGTACGTCGTGGAGTC-3',下游引物为5'-GCTGATGATCTTGAGGCTGTTGTC-3'。PCR反应体系为20μL,反应条件为:95℃预变性5 min,95℃变性15 s,60℃退火30 s和72℃延伸30 s,共45个循环。以无菌双蒸水代替cDNA作为阴性对照。以3-磷酸甘油醛脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)为内参,按2-△△CT方法计算目的基因相对表达量。

1.3 统计学处理 应用SPSS 21.0统计学软件进行数据分析。计量资料以±s表示,组间比较采用成组资料t检验;计数资料以频数和率表示,组间比较采用χ2检验。用Pearson相关系数分析相关性。采用Kaplan-Meier法进行生存曲线分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 乳腺癌及癌旁组织中RPL22的表达 免疫荧光法检测显示,RPL22在乳腺癌组织中的表达低于癌旁组织(图1A)。qRT-PCR法检测显示,RPL22 mRNA在乳腺癌组织中的表达量亦明显低于癌旁组织,差异有统计学意义(P<0.001)(图1B、C)。

图1 RPL22在乳腺癌及癌旁组织中的表达

2.2 乳腺癌及癌旁组织中RPL22表达量与临床病理参数的相关性 对RPL22表达量与乳腺癌患者临床病理参数进行相关性分析,结果显示乳腺癌组织中RPL22表达量与肿瘤直径(r=-0.403)、HER-2阳性(r=-0.390)、Ki67表达(r=-0.370)、淋巴结转移(r=-0.422)以及三阴性乳腺癌(TNBC)(r=-0.311)呈负相关,而与患者年龄、肿瘤TNM分级、肿瘤Grade分期、ER、PR以及脉管侵犯等无相关性。见表1。HER-2阳性定义为免疫组化结果为Cerb-2 3+或原位杂交HER-2阳性(扩增)[5]。

表1 RPL22表达与临床病理参数的关系例

2.3 TCGA数据库中RPL22在乳腺癌组织中的表达以及与预后的关系 通过检索TCGA数据库,发现与对照的乳腺组织相比,RPL22在乳腺癌组织中的表达水平明显降低(图2A)。Kaplan-Meier生存曲线分析显示,RPL22低表达组总生存率低于高表达组,差异有统计学意义(P=0.036)(图2B)。

图2 RPL22在乳腺癌中的表达及其与预后的关系

3 讨 论

核糖体蛋白(RPs)是核糖体的主要成分,可催化细胞质中蛋白质生物合成。越来越多的证据表明,核糖体蛋白在调节发育和疾病进展中起着关键作用[6],同时也参与细胞增殖和凋亡等生理过程[7]。人类部分癌症可激活TOR(target of rapamycin)通路,驱动核糖体的生物合成,促使癌细胞不断增长[8]。RPL22作为核糖体蛋白家族成员,参与人体内多种生物途径。已有研究表明其与抑癌基因p53密切相关,它通过抑制MDM2而激活p53,进而抑制癌细胞增殖[4,9]。此外也有研究证实RPL22在体外与酪蛋白激酶2α(CK2α)相互作用,抑制其底物的磷酸化,导致CK2α的失调,从而影响细胞增殖和凋亡,具备抑制癌症的作用[10]。这些研究揭示了RPL22在肿瘤抑制上的多种作用机制,展现其巨大的研究价值。

本研究显示,RPL22在乳腺癌组织中的表达水平低于癌旁组织,RPL22表达水平与肿瘤大小、HER-2阳性、Ki67表达、淋巴结转移以及三阴性乳腺癌的发生呈负相关。我们发现这些与RPL22表达差异相关的因素在临床中往往预示患者肿瘤进展程度以及术后风险。例如当RPL22表达越低时,肿瘤直径就越大,TNM分期也就越高。术后病理检测表明,在RPL22表达较低的肿瘤中,出现HER-2阳性、Ki67高表达以及淋巴结转移更多,三阴性乳腺癌也显著增多,这些都与乳腺癌的恶性程度以及复发风险密切相关[11]。另外,我们检索了TCGA数据库,使用Kaplan-Meier生存曲线进行分析,发现低表达RPL22的患者总生存时间低于高表达的患者(P=0.036),提示RPL22在乳腺癌患者体内的抑癌作用。RPL22有望成为乳腺癌诊断和预后新的标志物,并为治疗提供新的靶点。

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