MicroRNA-140抑制胃癌细胞的增殖和侵袭*

傅卫红，倪庆锋

（南通大学附属医院1胸外科；2胃肠外科，江苏 226001）

胃癌是世界上发病率最高的恶性肿瘤之一,主要致病因素包括饮食因素、环境因素、慢性幽门螺旋杆菌感染以及遗传易感性等[1]。2018年全球有784 000人死于胃癌,高发病区集中在东亚、东欧以及南美洲[2]。我国是胃癌高发地区,随着人民生活和卫生水平的提高,胃癌发生率和死亡率逐年降低,但仍是排名第二的癌症死亡原因[3-4]。近年来随着外科技术、放化疗、新辅助治疗、分子靶向治疗以及早期诊断方法的应用,全球胃癌患者5年生存率有所提高,但在东亚国家尤其是在中国胃癌5年生存率依然很低[5-6]。因此,筛选有效的胃癌诊断指标及治疗靶标,对改善患者的预后具有重要意义。

微小RNA(microRNAs,miRNAs)是一类长约22个核苷酸的单链、非编码RNA,通过序列特异性方式抑制mRNA翻译蛋白或诱导mRNA降解,参与肿瘤细胞增殖、凋亡、分化、迁移等多种生物学行为,miRNAs作为抑癌基因或致癌基因参与胃癌的发生和发展[7-8]。在神经胶质细胞瘤和宫颈癌中,miR-140通过抑制细胞增殖、侵袭和转移发挥抑癌作用[9-10]。本实验收集我院2020年1月—12月行胃癌根治手术切除的胃癌及其癌旁组织标本40例,采用实时荧光PCR检测胃癌、癌旁组织及胃癌细胞系中miR-140含量,并通过在胃癌细胞株中过表达及干扰miR-140,分析miR-140对胃癌细胞增殖和侵袭的作用,为胃癌治疗提供新思路。

1 材料与方法

1.1 组织标本 胃癌根治手术切除的胃癌及癌旁组织标本40例,其中男性24例,女性16例,年龄35～63岁,平均48.3±3.7岁。所有组织标本均经病理学检查确认,在手术后立即储存在液氮中备用。本研究经南通大学附属医院伦理委员会批准。

1.2 胃癌细胞系 人胃癌细胞系AGS、MKN45、MKN28、SGC7901、BGC823及正常人胃黏膜上皮细胞GES-1(美国ATCC公司),在含10%胎牛血清、链霉素(50μg/mL)和青霉素(50 U/mL)的RPMI-1640培养基中于5% CO2,37℃细胞培养箱培养。

1.3 实验方法

1.3.1 RNA提取及实时荧光定量PCR检测miR-140：采用TRIzol(Invitrogen公司)提取组织及胃癌细胞系RNA,参照试剂盒说明书操作,通过反转录试剂盒(TaKaRa公司)将RNA逆转录cDNA。miR-140表达水平采用TaqMan MicroRNA试剂盒检测,反应条件：预变性,95℃,5 min,1个循环;循环反应：95℃,10 s,60℃,30 s,40个循环。U6为内参,以2-ΔCt和2-ΔΔCt进行定量。实验重复3次。

1.3.2 miR-140模拟物和抑制剂转染：采用Lipofectamine 3000试剂(Invitmgen公司)转染miR-140模拟物及其对照(模拟物NC),miR-140抑制剂及其对照(抑制剂NC),参照试剂盒说明书操作。

1.3.3 细胞增殖实验：将100μL培养基内的转染细胞接种到96孔板,每孔约1 000个细胞,37℃下培养,使用CCK-8试剂盒(Dojindo Laboratories),在0 h,24 h,48 h,72 h和96 h测量450 nm处吸光度,绘制胃癌细胞生长曲线。

1.3.4 克隆形成实验：将转染的胃癌细胞接种在6孔板,500个细胞/孔,培养2～3周。PBS洗涤2次,多聚甲醛固定30 min,然后用结晶紫染色,计数大于2 mm的克隆。

1.3.5 细胞小室迁移及侵袭能力检测：采用Invasion：Transwell小室(BD Biosciences),纤维素膜孔径为8 mm。侵袭实验：先在小室底部铺上Matrigel胶,下室中加入含有10%胎牛血清的RPMI-1640培养基750μL,上室中加入无胎牛血清的RPMI-1640培养基500μL及1×105个细胞悬液,在5%CO2,37℃下培养48 h。小室下表面细胞用多聚甲醛固定,Giemsa染色,显微镜下观察并拍照,计数穿膜细胞。迁移实验小室底部不铺Matrigel胶,其余步骤同侵袭实验。

1.3.6 划痕实验：用标记笔在6孔板背后均匀划横线,间隔0.5～1 cm,每孔至少穿过5条线。每孔加入约5×105个转染细胞,过夜,次日用移液枪枪头垂直于板后的横线划痕,去除划下的细胞。加入无血清培养基,放入5% CO2,37℃培养箱培养,于0 h和48 h拍照。

1.3.7 EdU实验：取对数生长期细胞接种于96孔板,根据EdU染色试剂盒说明书,用完全培养基将EdU稀释到10μmol/L,每孔中加入100μL,孵育4 h后吸除培养基,用PBS清洗两遍,多聚甲醛固定,Apollo染色,立即检测细胞增殖情况。

1.4 统计学处理 使用SPSS 19.0和GraphPad Prism 7.0统计学软件进行数据分析。计量资料以±s表示,组间比较采用双侧t检验。P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 胃癌组织和胃癌细胞系miR-140低表达qRTPCR检测显示,与癌旁组织相比,胃癌组织中miR-140表达显著下调,差异有统计学意义(P＜0.01)(图1A)。与GES-1正常人胃黏膜上皮细胞系相比,AGS、MKN45、MKN28、SGC7901、BGC823胃癌细胞系miR-140表达下调,差异均有统计学意义(P＜0.05),其中SGC7901表达最低,AGS表达最高(图1B)。在后续功能实验中选择SGC7901作为过表达的细胞模型,而AGS作为干扰的细胞模型。

图1 胃癌组织和胃癌细胞系miR-140低表达

2.2 miR-140过表达抑制SGC7901细胞增殖 与模拟物NC转染的SGC7901细胞相比,miR-140模拟物转染细胞miR-140表达水平更高,差异有统计学意义(P＜0.01)(图2A)。CCK-8实验显示,与模拟物NC转染细胞相比,miR-140模拟物转染的SGC7901细胞增殖能力明显减弱,差异有统计学意义(P＜0.01)(图2B)。克隆形成实验发现,miR-140模拟物转染的SGC7901细胞克隆形成能力明显减弱,差异有统计学意义(P＜0.05)(图2C)。EdU实验显示,与模拟物NC转染细胞相比,miR-140模拟物转染的SGC7901细胞DNA合成能力明显减弱,差异有统计学意义(P＜0.05)(图2D)。

图2 miR-140过表达抑制SGC7901细胞增殖

2.3 miR-140过表达抑制SGC7901细胞迁移和侵袭 细胞小室迁移实验显示,miR-140模拟物转染的SGC7901细胞穿过小室基底膜的数目明显少于转染模拟物NC细胞,差异有统计学意义(P＜0.05)(图3A)。侵袭实验显示,miR-140模拟物转染SGC7901细胞后,穿膜细胞数量明显减少,差异有统计学意义(P＜0.05)(图3B)。划痕实验发现,转染miR-140模拟物的SGC7901细胞的迁移能力明显弱于转染模拟物NC细胞,差异有统计学意义(P＜0.01)(图3C)。

图3 miR-140过表达抑制SGC7901细胞迁移和侵袭

2.4 干扰miR-140促进AGS细胞增殖 将miR-140抑制剂和抑制剂NC转染到AGS细胞中,与抑制剂NC转染的AGS细胞相比,miR-140抑制剂转染细胞中miR-140表达水平明显降低,差异有统计学意义(P＜0.01)(图4A)。CCK-8试验显示,与抑制剂NC转染细胞相比,miR-140抑制剂转染的AGS细胞增殖能力明显增强,差异有统计学意义(P＜0.05)(图4B)。克隆形成实验发现,与抑制剂NC转染细胞相比,miR-140抑制剂转染的AGS细胞克隆形成能力明显增强,差异有统计学意义(P＜0.01)(图4C)。EdU实验显示,与抑制剂NC转染细胞相比,miR-140抑制剂转染的AGS细胞DNA合成能力明显增强,差异有统计学意义(P＜0.05)(图4D)。

图4 干扰miR-140促进AGS细胞增殖

2.5 干扰miR-140促进AGS细胞迁移和侵袭 细胞小室迁移实验显示,转染miR-140抑制剂的AGS细胞穿过小室基底膜的数目明显多于转染抑制剂NC的细胞,差异有统计学意义(P＜0.01)(图5A)。侵袭实验显示,转染miR-140抑制剂的AGS细胞穿膜细胞数量明显增加,差异有统计学意义(P＜0.01)(图5B)。划痕实验发现,转染miR-140抑制剂的AGS细胞迁移能力明显强于转染抑制剂NC细胞,差异有统计学意义(P＜0.01)(图5C)。

图5 干扰miR-140促进AGS细胞迁移和侵袭

3 讨 论

在大多数恶性肿瘤中往往出现染色体断裂、缺失、扩增及染色体转位等,导致抑癌基因失活和原癌基因过表达[11]。胃癌是分子和表型高度异质性疾病[12],发病风险因素包括幽门螺杆菌感染、年龄、高盐摄入以及进食水果和蔬菜偏少等。最近发现在美国25～39岁的非贲门胃癌发病率增加了70%[13],表明胃癌发病的风险因素仍需广泛调查。另外,约10%胃癌表现为家族性聚集,1%～3%胃癌患者存在特定突变[14]。

研究证实,除了编码蛋白质的mRNA,miRNA和癌症发生、发展有密切关系[15],大量miRNA在基因转录后调控过程中起着至关重要的作用,它们参与细胞生长、发育、分化、增殖和凋亡等过程[16]。癌症相关miRNA可以分为致癌性miRNA和抑癌性miRNA[17-18],前者促进癌症发展,后者的作用相反。miR-200家族成员在乳腺癌中起着抑癌作用,阻止上皮-间质转化过程[19-20]。研究发现miR-let-7在视网膜母细胞瘤中低表达,可能与视网膜母细胞瘤的发生、发展有关,认为血浆miR-320,miR-let-7e和miR-21是诊断视网膜母细胞瘤的潜在生物标志物[21-22]。在乳腺癌,骨肉瘤,结肠癌,肝细胞性肝癌和非小细胞肺癌中对miR-140生物学功能进行研究[23-26],重点关注miR-140在调节肿瘤细胞恶性表型中的各种作用,如miR-140抑制乳腺癌干细胞自我更新和生长[27],抑制食管癌细胞的侵袭[28]。

本研究发现,与癌旁组织相比,胃癌组织中miR-140低表达,提示miR-140在胃癌发展中起抑制作用,过表达miR-140可减弱SGC7901细胞增殖、迁移和侵袭能力,而干扰miR-140则可增强AGS细胞增殖、迁移和侵袭能力,提示miR-140可能成为胃癌治疗的新靶点。