木樨草素对弗氏佐剂诱导大鼠关节炎的改善作用及其机制*

施凤超，朱文峰，朱宇伟，王 成，周 敦

（盐城市第三人民医院/南通大学第六附属医院骨科，江苏 224001）

类风湿性关节炎(RA)是慢性炎症性自身免疫性疾病,主要表现为滑膜炎、关节病、骨损害及全身并发症[1]。目前关于RA致病因素和病理机制仍未完全明确,临床上治疗可减轻患者症状,延缓病变进展,但不能根治。RA病理改变主要包括慢性滑膜炎症、滑膜增生和炎性细胞浸润,炎性细胞因子促进全身或局部炎症过程,增加基质金属蛋白酶的产生和释放,导致细胞外基质降解和骨侵蚀[2]。持续过量的炎性细胞因子导致慢性炎症和类风湿性关节炎的发展[3]。有研究显示,HMGB1/TLR/NF-κB途径在RA发生和发展中起重要作用[4-5]。双氯芬酸钠(diclofenace sodium,DS)为经典的非甾体类抗炎药,通过抑制花生四烯酸环氧酶系统,导致前列腺素生成减少,具有消炎、镇痛的作用,可用于缓解关节炎患者的病情,但长期应用易产生不良反应,尤其是胃肠道,因此寻找有效、安全的药物有重要意义。木樨草素(luteolin,Lu)是食物中常见的类黄酮,具有自由基清除、抗癌和抗炎活性等多种药理作用[6-9]。本研究通过弗氏佐剂诱导大鼠关节炎模型,探讨木樨草素对关节炎的改善作用及其可能机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物和试剂 雄性SD大鼠50只,8周龄,体重200～250 g[中国南京江宁青龙山动物养殖场提供,SCXK(苏)02016-0010]。木樨草素(国家食品和药物管制研究所,纯度97%,批号20192011)。肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)和白细胞介素-1β(IL-1β)酶联免疫检测试剂盒(南京科创生物技术有限公司)。所有抗体均购自CST公司。

1.2 实验动物分组50只大鼠随机分为正常对照组、弗氏佐剂性关节炎(AA)组、DS组、Lu 20组和Lu 40组,每组10只。除正常对照组外,其余各组大鼠于第0天在左后足背注射0.1 mL弗氏完全佐剂(FCA),建立关节炎模型。实验第21～28天每日DS组大鼠口服双氯芬酸钠5 mg/kg,Lu 20组和Lu 40组分别口服木樨草素20 mg/kg和40 mg/kg,正常对照组和AA组口服等量生理盐水。

1.3 左后足体积测量 注射弗氏佐剂后,每7天采用排水法检测大鼠左后足踝关节体积(HPV),测量3次,取平均值,以评估肿胀程度[10]。

1.4 细胞因子测定 实验第29天以3 %水合氯醛麻醉大鼠,颈动脉采血,离心取血清。然后处死大鼠,取下踝关节标本。采用酶联免疫法检测血清和踝关节滑膜液中IL-6、IL-1β及TNF-α水平,严格按照试剂盒说明书操作,在分光光度计450 nm处读取吸光度。

1.5 组织病理学检查 取踝关节滑膜标本,以10%中性福尔马林固定24 h,石蜡包埋,5μm厚切片,苏木精-伊红染色,光镜下观察细胞浸润、血管翳形成和水肿程度等病理变化。

1.6 蛋白质印迹分析 取关节滑膜组织,在含0.1%苯基甲磺酰氟的冷RIPA缓冲液中匀浆,12 000 rpm离心20 min,收集上清液,采用BCA法测定其蛋白质浓度。将蛋白质提取物进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,然后转移至聚偏氟乙烯膜上,以5%脱脂乳在tris缓冲液中封闭,然后加入相应的一抗,在4℃下孵育过夜。tris缓冲液-吐温20(TBST)洗涤后,加入辣根过氧化物酶结合的二抗(1∶10 000),室温下孵育1 h。采用增强化学发光法(ECL)检测,通过图像分析软件(Bio-Rad实验室)进行定量。

1.7 统计学处理 采用SPSS 23.0统计学软件进行数据分析。计量资料以±s表示,组间差异性比较采用方差分析和图基多重比较检验。P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 木樨草素对关节炎大鼠左后足肿胀程度的影响 实验开始时,各组间大鼠左后足HPV比较,差异均无统计学意义(P＞0.05)。AA组注射弗氏佐剂后第7、14、21天左后足HPV进行性升高,与正常对照组相比,差异均有统计学意义(P＜0.01)。注射佐剂后第28天Lu 20组、Lu 40组及DS组大鼠左后足HPV明显减小,与AA组相比,差异均有统计学意义(P＜0.01),但Lu 20组、Lu 40组、DS组3组间比较,差异均无统计学意义(P＞0.05)。见图1。

图1 木樨草素对关节炎大鼠脚肿胀体积的影响

2.2 木樨草素对关节炎大鼠血清及滑膜液中细胞因子水平的影响 与正常对照组相比,AA组大鼠血清及滑膜液中IL-6、IL-1β和TNF-α水平显著升高,差异均有统计学意义(P＜0.01)。Lu 20组、Lu 40组及DS组大鼠血清及滑膜液中IL-6、IL-1β和TNF-α水平明显低于AA组,差异均有统计学意义(P＜0.01),而Lu 20组、Lu 40组、DS组3组间比较,差异均无统计学意义(P＞0.05)。见图2。

图2 木樨草素对关节炎大鼠血清（A）及滑膜液（B）中细胞因子水平的影响

2.3 组织病理学检查结果 正常对照组大鼠踝关节组织结构正常,AA大鼠踝关节出现明显的滑膜水肿、炎性细胞浸润、上皮变性和关节软骨糜烂。与AA组相比,Lu 20组、Lu 40组及DS组大鼠关节滑膜水肿、炎性细胞浸润、上皮变性及关节软骨糜烂明显减轻。Lu 20组、Lu 40组、DS组病理改变无明显差异。见图3。

图3 木樨草素对关节炎大鼠滑膜组织病理改变的影响

2.4 木樨草素对关节炎大鼠滑膜组织中HMGB1/TLR/NF-κB信号蛋白表达的影响 蛋白印迹检测显示,与正常对照组比较,AA组大鼠滑膜组织中HMGB1、TLR4、MyD88、p-NF-κB-p65(P-P65)和p-IκBα蛋白表达水平显著上调;与AA组比较,Lu 20组、Lu 40组及DS组大鼠滑膜组织中上述蛋白水平均明显下调,而Lu 20组、Lu 40组、DS组之间无明显差异。见图4。

A：正常对照组;B：AA组;C：DS组;D：Lu 20组;E：Lu 40组。

3 讨 论

弗氏完全佐剂FCA是广泛使用的关节炎诱导工具,可以模拟人类关节炎组织学和临床特征,如关节肿胀、滑膜增生和软骨或骨降解[11]。完全佐剂暴露在皮下会导致动物爪子和脚踝出现明显关节炎,后爪体积是评价炎症程度和药效的主要指标。佐剂刺激后,大鼠体内产生多种炎症介质和细胞因子,刺激血管翳形成、滑膜增生和骨破坏加速关节炎形成。TNF-α刺激先天免疫级联反应,并模拟其他炎症细胞因子的分泌[12]。IL-1是关节炎大鼠软骨破坏和滑膜细胞自我增殖的重要因素[12-13]。IL-6是类风湿性关节炎滑膜中高度表达的细胞因子,可导致关节损伤[14-15]。本文结果发现,木樨草素与DS均可以显著改善佐剂诱导的大鼠关节肿胀,降低大鼠血清及滑膜液中IL-6、IL-1β和TNF-α水平,两者差异无统计学意义(P＞0.05)。

许多文献报道HMGB1通路在关节炎中的重要作用[16-18]。已证实HMGB1信号通路介导的NF-κB在类风湿性关节炎中发挥作用[19]。NF-κB是调节IL-1β、IL-6和TNF-α产生的重要分子[20]。在正常细胞中,失活的NF-κB被细胞质中的核因子κB蛋白捕获。IKK复合物含有IKKα和IKKβ,是调节IκB的主要物质[21]。在IκB磷酸化和降解后,NF-κB立即转移到细胞核,并促进细胞因子和炎症介质的表达[22]。为了探讨木樨草素作用的分子机制,本研究采用蛋白质印迹检测,结果显示,木樨草素与DS一样,能显著抑制关节炎大鼠滑膜组织HMGB1、TLR4、MyD88、p-NF-κB-p65(P-P65)和p-IκBα蛋白表达,提示木樨草素对弗氏完全佐剂性关节炎的保护作用可能与抑制HMGB1/TLR/NF-κB信号通路有关。