ROS/pH双重响应的β-咔啉类探针H8DP的构建及肿瘤荧光成像研究*

单文配，陈 实，刘 云，王 晨，李洋阳，张延安1，，凌 勇1，

（南通大学1医学院；2药学院，江苏 226001）

近年来我国肿瘤发病率年均增长3.9%,死亡率年均增长2.5%[1]。正规治疗后早期癌症患者5年生存率70%～95%,而较晚期患者5年生存率仅10%～30%。因此,早期诊断肿瘤意义重大。荧光成像技术能实时、方便地可视化观察目标组织,侵袭性较低,是肿瘤早期诊断的有力工具[2]。目前荧光探针主要包括纳米探针和小分子荧光探针,两者相比,小分子荧光探针具有制备较容易、可控性高、生物相容性好等优势[3-4]。吲哚菁绿(ICG)、合亚甲基蓝(MB)是FDA批准的荧光染料,在临床上实现前哨淋巴结、神经内分泌肿瘤等的可视化[5],但由于ICG、MB处于“always on”状态,导致不必要的背景信号,信噪比不高,难以进一步提高诊断效能。而“on-off”式荧光探针在正常组织中不发光(off态),一旦进入肿瘤组织则会选择性发出荧光(on态),因而信噪比较高[6]。本研究设计、合成ROS/pH双重响应的β-咔啉类小分子荧光探针H8DP,从细胞和动物水平验证其对肿瘤组织选择性成像的效果,报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验材料 肿瘤细胞Hela和正常细胞LO2购自中国科学院生物化学与细胞生物学研究所,使用1640完全培养基于37℃、5% CO2培养箱中培养。雌性裸鼠(18～20 g)购自南通大学动物实验中心,将Hela细胞接种于裸鼠皮下,每只小鼠1×106个细胞,3～4周后用于动物成像研究。

1.2 化合物H8DP合成 将L-色氨酸(5.1 g,25 mmol)溶于70 mL甲醇,加入3,4,5-三甲氧基苯甲醛(5.3 g,27.5 mmol),90℃回流搅拌4 h,调节pH至5.0,析出黄色固体。将得到的固体溶于70 mL甲醇,-5℃条件下滴加5.45 mL SOCl2。恢复至室温,回流4 h,调节pH为8.0,析出固体。继续将固体溶于50 mL二甲基甲酰胺(DMF)中,-5℃机械搅拌下,分批加入KMnO4(5.57 g,35 mmol),搅拌抽滤,滤液加入冰水析出固体,抽滤干燥。干燥后固体溶于甲醇,加8.82 mL水合肼,60℃回流4 h,完全反应后冷却至0℃,抽滤得固体。所得固体用盐酸溶解,加入NaNO2,搅拌1 h,调节pH为8.0,析出固体。将固体立刻溶于60 mL水和冰醋酸(1∶1)混合溶液中,90℃回流搅拌5 h,反应完成后减压浓缩去溶剂,柱层析获得H8N固体。4-羟甲基苯硼酸频哪醇酯与对硝基苯基氯甲酸酯在0℃条件下溶于二氯甲烷(DCM)中,隔夜搅拌得到活性酯。将活性酯与H8N溶于二氯甲烷,加入N,N-二异丙基乙胺(DIPEA),室温搅拌6 h,减压浓缩去溶剂,柱层析得到淡黄色固体,回收52%,即为4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼烷-2-基)苄基(1-3,4,5-三甲氧基苯基)-9H-吡啶并[3,4-b]吲哚-3-基氨基甲酸酯(H8DP)。H8DP分析数据：1H NMR(400 MHz,DMSO)δ11.36(s,1H),10.13(s,1H),8.41(s,1H),8.19(d,J=7.8 Hz,1H),7.72(d,J=7.7 Hz,2H),7.64～7.44(m,4H),7.30～7.16(m,3H),5.26(s,2H),3.93(d,J=3.3 Hz,6H),3.78(s,3H),1.08(s,12H)。MS(ESI)m/z=610[M+H]+;HRMS(ESI)：m/z calcd for C34H36BN3O7：610.2722;found：610.2737[M+H]+。13C NMR(101 MHz,DMSO)δ 154.21,153.46,143.34,142.63,140.80,140.07,138.45,135.00,133.60,132.16,130.61,128.81,127.35,121.98,121.41,119.75,112.87,106.35,84.15,74.00,56.35,25.42,25.13。

1.3 紫外、荧光光谱测定 以1%(v/v)DMSO水溶液制备样品溶液,pH范围4.5～7.4。使用UV1800PC光谱仪(中国菁华仪器有限公司)获得紫外可见光谱,RF-5301PC荧光分光光度计(日本岛津仪器有限公司)获得荧光光谱。

1.4 共聚焦成像 取正常生长状态的Hela细胞和LO2细胞,在5μmol/L H8DP溶液中孵育2 h,使用LeicaTCS SP5 LSM共聚焦显微镜40×物镜观察细胞成像效果。

1.5 离体组织荧光成像实验 经裸鼠尾静脉注射H8DP(40 mg/kg),依照时间点处死,收集心、肝、脾、肺、肾和肿瘤组织,运用荧光成像系统成像,将各组织切片在共聚焦显微镜下观察荧光。

2 结 果

2.1 化学合成路线 如图1所示,初始原料L-色氨酸与3,4,5-三甲氧基苯甲醛根据Pictet-Spengler法经过环合(a),甲酯化(b),芳构化(c),酰肼化(d),叠氮化(e)和叠氮重排(f)6步反应后得到H8N。4-羟甲基苯硼酸频哪醇酯(8)与对硝基苯基氯甲酸酯在0℃条件下得到活性酯(9),活性酯进攻H8N上氨基(h)得到最终化合物H8DP(10)。

图1 H8DP合成路线

2.2 H8N紫外、荧光的pH敏感性 在pH 3.41～7.64范围内H8N紫外和荧光的变化趋势见图2。H8N紫外吸收峰随pH降低,从400 nm向440 nm偏移(图2A)。在440 nm波长激发下,H8N荧光强度变化尤其敏感。pH 7.56时荧光强度很弱,随着pH降低,荧光强度迅速增强,最高可达到pH 7.56时的30倍(图2B),说明H8N具有pH敏感的紫外、荧光特性。

图2 H8N紫外、荧光的pH敏感性

2.3 H8DP紫外吸收评价 紫外光谱扫描显示,H8DP在380 nm左右处有自身的特征吸收峰,以380 nm波长激发基本无荧光信号,说明硼酸酯结构的引入掩蔽了H8N的荧光。见图3。

图3 H8DP紫外吸收图谱

2.4 H8DP的ROS/pH双重响应紫外荧光特性 为了证明H8DP可以被ROS响应降解,选用过氧化氢(H2O2)模拟体外ROS响应性。在50μmol/L H8DP的甲醇∶水=1∶1的溶剂体系里,添加1 mmol/L H2O2,在0 min、5 min、10 min、20 min、30 min、1 h、2 h、4 h各时间点检测紫外吸收峰,汇总如图4。从图中可见H8DP在380 nm左右处的特征峰逐步降低,并产生440 nm处的新吸收峰,且与H8N在酸性条件下特征峰吻合,说明H8DP在ROS作用下降解产生H8N,具有ROS响应性。

图4 H8DP（50μmol/L）对ROS响应降解图

我们将1μmol/L H8DP在H2O2处理前后的溶液以440 nm激发,对比二者的荧光强度。结果显示,H2O2处理后的荧光强度大大提升,超过处理前的100倍(图5),说明H8DP在ROS激活前后具有明显的荧光信号变化,可以在特定部位(如肿瘤组织)特异性成像。

图5 H8DP（1μmol/L)在ROS响应前后的荧光变化图（λex=440 nm）

2.5 H8DP细胞荧光成像评价 采用共聚焦显微镜观察H8DP在肿瘤细胞Hela和正常细胞LO2中荧光成像(图6)。Hela细胞内荧光显著,说明H8DP在Hela细胞内能被ROS和pH响应,而在LO2细胞中基本看不到荧光,说明H8DP可选择性在肿瘤细胞内荧光成像。

图6 H8DP在肿瘤细胞和正常细胞内荧光成像（λex=405 nm）

2.6 H8DP动物组织和切片成像评价 裸鼠离体组织成像显示,H8DP可选择性地对肿瘤组织荧光成像,而在正常组织中荧光均很弱;共聚焦显微镜观察组织切片,显示H8DP对肿瘤组织选择性成像(图7)。

图7 H8DP动物组织切片成像

3 讨 论

“on-off”式小分子荧光探针主要由荧光片段和响应片段构成,响应片段能被靶组织的生物标志物选择性切断,释放出荧光片段。肿瘤细胞在缺氧条件下优先进行糖酵解,产生H+,使肿瘤组织具有微酸性(pH为6.5～6.8)[7],而正常组织pH为7.2～7.4[8]。活性氧(ROS)在正常生理条件下执行信号传递功能,但过量ROS可引起氧化应激反应,与包括癌症在内的许多疾病的发生发展有关[9]。本研究基于肿瘤组织较低的pH和较高的ROS水平,设计能在肿瘤组织中选择性发光的小分子荧光探针。β-咔啉是一类天然存在的吲哚类生物碱,本研究在β-咔啉的3位引入供电子基团氨基,利用分子内电荷转移(ICT)效应,获得的化合物H8N可产生pH敏感性荧光,荧光强度在pH 3.55～7.56范围内变化明显,适合肿瘤pH环境下成像。同时H8N克服了传统pH荧光探针中腙键或缩醛基团存在的不稳定、显色较慢等问题。我们进一步在H8N氨基上引入ROS敏感的硼酸酯结构,产生“开-关”(on-off)型成像模式,合成具有ROS和pH双重响应的β-咔啉类荧光探针H8DP。细胞水平实验显示,Hela肿瘤细胞内荧光显著,而在LO2正常细胞中基本看不到荧光;动物实验显示,H8DP选择性对肿瘤组织荧光成像,而在正常组织中荧光均很弱。说明H8DP具有成为肿瘤选择性荧光探针的潜力,对肿瘤早期诊断具有良好的应用前景。