肠道病毒71型灭活疫苗体外和体内相对效力试验的相关性

周振歆，易力，张晗，赵勇，杨骄雪，王丹丹，苗睿，张玉平，董少忠

中国医学科学院 北京协和医学院医学生物学研究所，云南昆明650031

肠道病毒71型（enterovirus 71，EV71）是导致儿童及婴幼儿手足口病（hand，foot and mouth disease，HFMD）重症和死亡病例的主要病原体［1-2］。过去40余年，HFMD在欧洲、美洲及亚太地区暴发流行，2008—2014年间，我国儿童HFMD患者超过1 200万例，死亡约3 200例，对儿童及婴幼儿生命健康构成严重威胁［3-5］。由于尚无明确治疗HFMD的药物上市，疫苗仍是控制HFMD流行的主要手段［6-7］。EV71灭活疫苗自2015在中国获批上市，显示出良好的有效性及安全性［8-10］，保护率达90%以上，且免疫后第2年保护力仍较高［11-12］。

根据国家药品监督管理部门批准的企业注册标准，EV71灭活疫苗的效力试验包括体外相对效力试验和体内效力试验，体外相对效力试验为抗原含量测定，体内效力试验包括ED50效力试验和中和抗体效价测定。体内相对效力试验操作周期长，检测结果受试验动物个体差异的影响较大，且受动物伦理的约束，因此，用简便有效的体外相对效力试验替代体内相对效力试验显得尤为重要，建立替代方法的基础是疫苗生物活性成分含量与免疫效果是否具有相关性［13］。本实验以EV71灭活疫苗上市以后一个自然年内生产的62批EV71灭活疫苗成品为研究对象，对其进行抗原含量、半效稀释倍数、ED50效力、中和抗体效价检测，并对抗原含量与半效稀释倍数、抗原含量与ED50效力、抗原含量与中和抗体效价、ED50效力与中和抗体效价之间的相关性进行评价。

1 材料与方法

1.1 供试品及标准品 供试品为中国医学科学院医学生物学研究所EV71灭活疫苗上市以后一个自然年内生产的62批EV71灭活疫苗成品（完成企业自检，并取得批签发合格证）；EV71抗原标准品由中国食品药品检定研究院提供。

1.2 细胞及病毒RD细胞购自ATCC；EV71 FY-523毒株由中国食品药品检定研究院提供；EV71灭活病毒液由中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所制备。

1.3 主要试剂TritonX-100、二乙醇胺及0.05%的聚山梨酯20购自美国Sigma公司；显色A液（TMB溶液）、B液（醋酸缓冲液）购自美国Seracare-KPL公司；酶结合物（亲和素标记的HRP）购自美国Thermo Fisher公司；EV71抗原检测板（包被兔抗EV71多克隆抗体）、生物素标记的EV71抗体、PBS（0.01 mol／L，pH 7.4±0.2）、2 mol／L H2SO4及0.35 mg／mL Al（OH）3均由中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所制备。

1.4 实验动物SPF级BALB／c小鼠，35～42日龄，体重18～22 g，由中国医学科学院医学生物学研究所提供，动物生产许可证号为：SCXK（滇）K2014-0002。

1.5 抗原含量的检测 用PBS对标准品和解离后的供试品（采用TritonX-100和二乙醇胺对供试品进行解离）进行2倍系列稀释，取5～8个稀释度，加入至EV71抗原检测板，每个稀释度设2个复孔，100 μL／孔，同时设阳性对照（EV71灭活病毒液）、阴性对照（PBS）及空白对照，（37±1）℃孵育1 h；洗涤液（含0.05%聚山梨酯20的PBS）洗涤5次，加入生物素标记的EV71抗体，100 μL／孔，（37±1）℃孵育1 h；洗涤液洗涤5次，加入显色液A、B液，均50 μL／孔，37℃避光显色10 min；加入终止液（2 mol／L H2SO4），50 μL／孔，终止反应，用酶标仪检测A450值。采用量反应平行线测定法计算抗原含量［14］，单位以U／mL进行统计。

1.6 ED50效力试验 用0.35 mg／mL Al（OH）3将供试品分别按1∶16、1∶32、1∶64稀释，经腹腔接种小鼠，1.0mL／只，每个稀释度10只，接种28 d，经眼球或心脏采血，分离血清。将血清稀释为1∶4～1∶16，加入EV71 FY-523，50 μL／孔（剂量为100 CCID50／孔），同时设细胞对照（100 μL稀释液）、血清对照（50 μL供试品血清+50 μL稀释液）和病毒对照（50 μL EV71 FY-523+50 μL稀释液），均设2个复孔，37℃中和2 h；加入RD细胞悬液，100 μL／孔，（37±0.5）℃培养7 d。以1∶8血清稀释度供试品孔细胞未发生病变判为EV71中和抗体阳性，并按下式（Reed-Muench法）计算半效稀释倍数，ED50效力为抗原含量与半效稀释倍数的比值，单位以U／mL统计。

半效稀释倍数=lg-1［lg大于50%阳转率稀释度+（大于50%阳转率-50%）／（大于50%阳转率-小于50%阳转率）×lg2］

1.7 中和抗体效价的检测 将原倍供试品经腹腔注射小鼠，0.5 mL／只，接种后28 d，经眼球或心脏采血，分离血清。将抗体稀释为1∶4～1∶512，其他检测步骤同1.6项。以1∶8血清稀释度供试品孔细胞未发生病变判为EV71中和抗体阳性，反之判为阴性，计算中和抗体GMT值，以GMT值除以8作为1个效力单位，单位以EU统计。

1.8 相关性分析 将62批EV71灭活疫苗的抗原含量与半效稀释倍数、ED50效力、中和抗体效价进行相关性分析；同时，将62批EV71灭活疫苗的ED50效力与中和抗体效价进行相关性分析。应用SPSS 20软件统计抗原含量、半效稀释倍数、ED50效力、中和抗体效价的正态分布情况，再进行Pearson相关性检验，以P＜0.05为差异有统计学意义，并绘制相关性散点图。

2 结果

2.1 抗原含量、半效稀释倍数、ED50效力、中和抗体效价的检测62批EV71灭活疫苗成品抗原含量、半效稀释倍数、ED50效力、中和抗体效价检测结果均服从正态分布。抗原含量为200～320 U／mL，均值为248.645U／mL，标准差为26.530 0 U／mL；半效稀释倍数为13.8～26.7，均值为18.960，标准差为2.521 1；ED50效力为5.1～7.8 U／mL，均值为6.606 U／mL，标准差为0.608 4 EU；中和抗体效价为3.5～7.4 EU，均值为5.345 EU、标准差为0.883 5 EU。

2.2 相关性分析

2.2.1 抗原含量与半效稀释倍数的相关性62批EV71灭活疫苗抗原含量与半效稀释倍数呈良好正相关（r=0.711，P＜0.01），见图1。

图1 EV71灭活疫苗抗原含量与半效稀释倍数相关性的散点图Fig.1 Scatter diagram of antigen content and median effective dilution factor of inactivated EV71 vaccine

2.2.2 抗原含量与ED50效力的相关性62批EV71灭活疫苗抗原含量与ED50效力无相关性（r=0.131，P＞0.05），见图2。

图2 EV71灭活疫苗抗原含量与ED50效力相关性的散点图Fig.2 Scatter diagram of antigen content and ED50 potency of inactivated EV71 vaccine

2.2.3 抗原含量与中和抗体效价的相关性62批EV71灭活疫苗抗原含量与中和抗体效价呈良好正相关（r=0.388，P＜0.01），见图3。

图3 EV71灭活疫苗抗原含量与中和抗体效价相关性的散点图Fig.3 Scatter diagram of antigen content and neutralizing antibody titer of inactivated EV71 vaccine

2.2.4 ED50效力与中和抗体效价的相关性62批EV71灭活疫苗ED50效力与中和抗体效价呈显著负相关（r=-0.356，P＜0.01），见图4。

图4 EV71灭活疫苗ED50效力与中和抗体效价相关性的散点图Fig.4 Scatter diagram of ED50 potency and neutralizing antibody titer of inactivated EV71 vaccine

3 讨论

体外和体内相对效力试验均可用于疫苗效力检测。体外相对效力试验具有灵敏、特异、快捷、准确等特点；体内效力检测需使用动物进行试验，其检验时间较长，易受动物的种属、窝别、年龄、性别、体重、健康状况、饲养营养及饲料环境等影响。根据WHO及国际生物制品标准化协会要求，尽量不使用动物法进行生物制品质量检定［15］，《中国药典》三部（2005版）［16］也规定，应尽量采用准确可靠的化学、物理学或细胞学方法取代动物试验进行生物制品质量检定，以减少采用动物进行试验，该版《中国药典》开始将重组酵母乙肝疫苗的体外抗原检测替代体内抗体检测作为疫苗效价指标。有研究基于同原理建立了灭活甲肝疫苗体外效力检测方法［17］，并收录至2005年后的各版《中国药典》中。因此，用体外相对效力试验代替动物体内效力试验是必然趋势［17］。

刘建生等［18］研究显示，抗原免疫剂量与半效稀释倍数之间存在良好的剂量-效应关系，半效稀释倍数与抗原免疫剂量呈正相关。本研究结果显示，62批EV71灭活疫苗的抗原含量与半效稀释倍数呈良好正相关（P＜0.01）。二者结论相符，即抗原含量越高，其半效稀释倍数越大；抗原含量越低，其半效稀释倍数越小。但抗原含量变化的幅度或倍数与半效稀释倍数变化的幅度或倍数并非完全一致，半效稀释倍数的结果受试验过程中单只或少数实验动物质量、敏感性波动的影响较大，ED50效力为抗原含量与半效稀释倍数的比值，因此，抗原含量与ED50效力可能出现正相关、负相关或不相关的情况。本研究中，抗原含量与ED50效力无相关性，符合试验特点、为合理结果。

韩金乐等［19］发现，的21株EV71抗原的特异比活与免疫血清中和抗体间存在强相关性；另外，毛群颖等［20］对免疫前抗体阴性的婴幼儿免疫后的血清进行中和抗体检测，结果表明，EV71灭活疫苗免疫后呈良好的剂量-效应关系。本研究结果表明，62批EV71灭活疫苗的抗原含量与中和抗体效价呈良好正相关（P＜0.01），与上述研究结果相符。

当疫苗抗原含量一定的情况下，ED50效力越低，表明其半效稀释倍数越大，试验动物阳转越高，疫苗免疫效果越好［21］，但对于中和抗体效价则相反，即中和抗体效价越高、疫苗保护效果越好［22］，因此，同批次疫苗，若ED50效力与中和抗体效价呈负相关，表明该疫苗的保护效果良好。本研究的结果显示，62批EV71灭活疫苗成品的ED50效力与中和抗体效价呈显著负相关（P＜0.01），表明检测的疫苗具有良好的免疫效果。

综上所述，体外相对效力试验（抗原含量测定）替代体内相对效力试验（ED50效力试验和中和抗体效价检测）用于EV71灭活疫苗效力检测具有可行性。