短发夹RNA沉默丝裂原活化蛋白激酶1对胃癌细胞生物学表型的影响及其分子机制

王转兄，宋耀辉，杜正平，陈熙，顾静，李海龙

1.甘肃中医药大学临床医学院临床检验诊断学教研室，甘肃 兰州730000；2.甘肃中医药大学基础医学院生理教研室，甘肃兰州730000

胃癌（gastric cancer，GC）是全球第五大常见恶性疾病，也是全球癌症相关死亡的第三大病因［1］，其发病率和死亡率在东亚地区较高［2］。GC的发生是一个复杂的过程，涉及宿主、环境和细菌因子之间的相互作用，导致遗传和表观遗传水平的改变。尽管胃镜检查和常规肿瘤生物标志物筛查已得到广泛应用，但由于早期GC无特定症状，大多数患者诊断时已为晚期，失去了手术机会，且晚期GC患者的预后较差，5年生存率为5%~20%，中位总生存期为10个月［3］。预后不良主要是由于癌细胞的侵袭和转移，也是GC相关复发和死亡的主要原因［4］。因此，迫切需要有价值和实用的生物标志物来筛选具有高风险的GC患者，有利于早期诊断及为每个患者建立有效的治疗策略。

丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）是由丝氨酸-苏氨酸激酶组成的蛋白激酶。研究表明，MAPK在生物进化过程中高度保守，MAPK能独立地将细胞外信号转导至细胞内，以调节相关基因的表达，并参与细胞有丝分裂、增殖、炎症、侵袭和转移等生理过程［5］。MAPK／ERK途径是接收多种刺激的输入会聚信号节点，信号通过MAPK途径传递激活下游底物，启动相关基因的表达，从而引起细胞增殖、侵袭和转移等生物学行为的激活或转化［6］。研究表明，许多MAPK通路酶在女性生殖道癌、乳腺癌、卵巢癌和宫颈癌中均有异常表达［7-8］，MAPK／ERK信号通路在GC细胞中被激活，PD98059通过抑制MAPK／ERK信号通路的活性可影响GC细胞的生物学功能。MAPK1也称为ERK2，是MAPK通路的亚家族。研究表明，MAPK1的激活与GC细胞的侵袭密切相关，在GC细胞系中敲低MAPK1表达可抑制细胞增殖、迁移及侵袭，诱导凋亡［9］。研究发现，miRNA可通过调节MAPK1来影响肿瘤的生物学行为［10］；GC中miR-585下调可致MAPK1增加，从而促进GC的增殖和转移［11］；miR-197和MAPK1在GC细胞中存在关联，且miR-197可通过直接靶向MAPK1诱导人GC细胞的凋亡，并降低其5-FU抗性［12］。MAPK1与GC的发生、发展密切相关。因此，本实验通过短发夹RNA（short hairpin RNA，shRNA）沉默SGC-7901及HGC-27细胞中的MAPK1，检测细胞增殖、迁移、侵袭能力和细胞周期、凋亡及其相关信号因子的表达情况，评价沉默MAPK1对GC细胞生物表型的影响及其作用机制。

1 材料与方法

1.1 细胞及病毒GC细胞SGC-7901和HGC-27、慢病毒LV-sh-Ctrl和LV-sh-MAPK1均购自上海吉凯基因科技有限公司。

1.2 主要试剂及仪器 高糖DMEM培养基购自兰州健顺生物科技有限公司；胎牛血清购自浙江天杭生物科技股份有限公司；青-链霉素、RIPA裂解液及蛋白酶抑制剂PMSF购自美国Solarbio公司；RNA裂解液RNAiso Plus及逆转录试剂盒购自日本TaKaRa Bio公司；兔抗人CDK1、CDK6、CCNB1、P53、BAX、Bcl-2、Caspase 3、C-Caspase 3、Caspase 9、C-Caspase 9多克隆抗体及HRP标记的山羊抗兔IgG购自美国GeneTex公司；兔抗MAPK1及GAPDH多克隆抗体购自上海YEASEN公司；流式细胞仪（型号FACSVerse）购自美国BD公司。

1.3 MAPK1在GC中表达的临床病理特征分析 应用TCGA数据库数据挖掘网站-UALCAN（http：／／ualcan.path.Uab.edu／index.html），提取GC患者MAPK1基因表达及与临床病理特征之间关系的数据，输入Graphpad软件，进行绘图，分析MAPK1在GC中表达的临床病理特征。

1.4 细胞培养 将SGC-7901和HGC-27细胞接种于含10%胎牛血清的DMEM培养基中，于37℃，5%CO2饱和湿度条件下培养，待细胞融合度达80%以上时，用0.25%胰酶消化，连续传3代，取第2代对数生长期细胞进行后续试验。

1.5 病毒感染 当SGC-7901和HGC-27细胞融合度达20%~30%时，按MOI=20分别感染慢病毒LVsh-MAPK1、LV-sh-Ctrl（分别为两种细胞的试验组及阴性对照组），于37℃培养12~16 h；更换为常规培养基，继续培养约72 h，镜下观察荧光细胞数。加入5 μg／mL嘌呤霉素，每隔3~4 d更换含嘌呤霉素的培养基，筛选感染稳定的细胞株进行后续试验。

1.6 GC细胞中MAPK1基因mRNA转录水平的检测采用RT-qPCR法。在Primer-Blast中登录http：／／blast.ncbi.nlm.nih.gov／网站，设计引物序列，MAPK1上游引物：5′-CGTTGGTACAGGGCTCCAGAA-3′，下游引物：5′-CTGCCAGAATGCAGCCTACAGA-3′，引物由宝生物工程（大连）有限公司合成。采用Trizol试剂提取各组细胞总RNA，逆转录合成cDNA，以其为模板进行PCR扩增。PCR扩增条件为：95℃预变性10 s，95℃变性10 s，60℃退火20 s，共40个循环。扩增后进行熔解曲线分析，内参基因为GAPDH，采用2-ΔΔCt法计算基因相对转录水平。

1.7 GC细胞中MAPK1蛋白表达水平的检测 采用Western blot法。用RIPA提取各组细胞总蛋白，经10%SDS-PAGE分离后，转移至PVDF膜上，用5%脱脂奶粉室温封闭1 h；加入兔抗MAPK1多克隆抗体及兔抗GAPDH多克隆抗体（1∶1 000稀释），4℃孵育过夜；用0.5%TBST洗涤3次，加入HRP标记的山羊抗兔IgG（1∶2 500稀释），37℃温育2 h；ECL法显色。

1.8 沉默MAPK1对GC细胞增殖能力影响的检测采用MTT法。将各组GC细胞按2×104个／mL加入96孔板，100 μL／孔，两种GC细胞均设空白对照组（不感染），每组设6个重复，于37℃，5% CO2细胞培养箱分别培养24、48、72 h；加入5 mg／mL的MTT溶液，20 μL／孔，继续培养4 h；弃培养基，加入DMSO溶液，150 μL／孔，避光振荡10 min，用酶标仪检测A490，并按下式计算细胞增殖率。试验重复3次。

细胞增殖率（%）=（试验组A490-空白对照组A490）／（阴性对照组A490-空白对照组A490）×100%

1.9 沉默MAPK1对GC细胞迁移能力影响的检测

1.9.1 细胞划痕愈合试验 将各组GC细胞按2.5×105个／mL加入6孔板，2 mL／孔，于37℃，5% CO2细胞培养箱中培养过夜；待细胞融合度达100%时，用200 μL枪头进行划痕，弃培养基，PBS洗涤3次，加入2 mL无血清培养基，继续培养48 h，于培养0及48 h时拍照。应用Image J软件检测划痕区面积值，并按下式计算细胞愈合率。试验重复3次。

愈合率（%）=（0 h细胞划痕面积-48 h细胞划痕面积）／0 h细胞划痕面积×100%

1.9.2 细胞Transwell小室试验 各组GC细胞经0.25%胰蛋白酶消化后，用无血清培养基重悬，浓度调节为5×105个／mL。将Transwell小室放入24孔板中，上室加入200 μL细胞悬液，下室加入500 μL含10% FBS的培养基，于37℃，5% CO2细胞培养箱培养24 h；弃小室内培养基，PBS洗涤3次，加入4%多聚甲醛，固定小室下侧细胞30 min；用0.1%结晶紫染色20 min，PBS洗涤3次，晾干，镜下观察计数。随机选取中央和四周5个视野，对迁移至Transwell下室的细胞进行计数。试验重复3次。

1.10 沉默MAPK1对GC细胞侵袭能力影响的检测采用细胞Transwell小室试验。将Transwell小室放入24孔板中，置于冰上，按50 μL／cm2加入4℃预冷的Matrigel基质，37℃放置30 min；将各组GC细胞用0.25%胰酶消化，用含无血清培养基重悬，浓度调节为5×105个／mL，加入Transwell小室内，继续培养24 h；固定染色，镜下观察计数。随机选取中央和四周5个视野，对迁移至Transwell下室的细胞进行计数。试验重复3次。

1.11 沉默MAPK1对GC细胞周期影响的检测 采用流式细胞术。将各组GC细胞用0.25%胰酶消化，收集细胞，预冷PBS洗涤2次，弃上清，加置1 mL预冷的70%乙醇，吹打混匀，4℃固定12 h；7 104×g离心5 min，预冷的PBS洗涤2次，加入PI和RnaseA，37℃避光温浴30 min，用流式细胞仪检测。试验重复3次。

1.12 沉默MAPK1对GC细胞凋亡能力影响的检测采用流式细胞术。将各组CG细胞用25%胰酶消化，收集细胞至离心管中，PBS洗涤2次，弃上清，用1×Binding Buffer重悬，每管加入5 μL AnnexinV-APC和10 μL 7-AAD，混匀，室温避光孵育15 min；每管加入380 μL预冷的1×Binding Buffer，用流式细胞仪检测。试验重复3次。

1.13 沉默MAPK1对GC细胞周期和凋亡相关分子表达影响的检测 采用Western blot法。用RIPA提取细胞总蛋白，经10% SDS-PAGE分离蛋白后，转移至PVDF膜上，用5%脱脂奶粉室温封闭1 h；加入兔抗人P53、CCNB1、CDK6、CDK1、Bax、Bcl-2、Caspase 3、Caspase 9、C-Caspase 3、C-Caspase 9、GAPDH多克隆抗体（1∶1 000稀释），4℃孵育过夜；用0.5%TBST洗涤3次，加入HRP标记的山羊抗兔IgG（1∶2 500稀释），37℃温浴2 h；ECL法显色。

1.14 统计学分析 应用SPSS 21.0统计软件进行统计学分析，计量资料以均值±标准差（±s）表示，组间两独立样本比较采用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MAPK1在GC中表达的临床病理特征分析与正常组织比较，MAPK1在原发性肿瘤中的表达明显升高（P＜0.01）；MAPK1在GC中的表达具有种族差异性，与正常组织比较，高加索人GC患者的表达量较高（P＜0.01），而非裔美国人和亚洲人中GC患者的MAPK1表达量无明显差异（P＞0.05）；在肿瘤病理分级和分期中，与正常组织比较，MAPK1表达量在2级（P＜0.01）、3级（P＜0.01）及2期（P＜0.05）、3期（P＜0.01）、4期（P＜0.01）明显升高。见图1。

图1 MAPK1在GC中表达的临床病理分析Fig.1 Clinical pathological analysis of MAPK1 expression in GC

2.2 慢病毒感染GC细胞的效果 各组GC细胞感染慢病毒后，荧光细胞数均占总细胞数的80%以上，见图2。SGC-7901-sh-MAPK1、SGC-7901-sh-Ctrl、HGC-27-sh-MAPK1及HGC-27-sh-Ctrl组细胞中MAPK1基因mRNA转录水平分别为0.25、0.98、0.20和0.95，MAPK1表达水平分别为0.37、1.00、0.18和0.99。SGC-7901-sh-MAPK1及HGC-27-sh-MAPK1组细胞中MAPK1基因mRNA转录及MAPK1表达水平均显著低于相应阴性对照组（t=-2.73～2.71，P＜0.01）。见图3。

图2 各组GC细胞的镜下观察（×100）Fig.2 Microscopy of gastric cancer cells in various groups（×100）

图3 Western blot法检测各组CG细胞中MAPK1的表达Fig.3 Western blotting of MAPK1 expression in gastric cancer cells in various groups

2.3沉默MAPK1对GC细胞增殖能力的影响 各组CG细胞的增殖率随培养时间的延长逐渐升高，感染72 h后，SGC-7901-sh-MAPK1及HGC-27-sh-MAPK1组的细胞增殖率明显低于相应阴性对照组（t分别为2.63和2.69，P＜0.01）。见图4。表明MAPK1下调可显著抑制SGC-7901及HGC-27细胞的增殖能力。

图4 各组CG细胞的细胞增殖率Fig.4 Proliferation rates of gastric cancer cells in various groups

2.4 沉默MAPK1对CG细胞迁移能力的影响

2.4.1 细胞划痕愈合试验SGC-7901-sh-MAPK1、SGC-7901-sh-Ctrl、HGC-27-sh-MAPK1及HGC-27-sh-Ctrl组细胞划痕愈合率分别为15%、66%、49%和77%。SGC-7901-sh-MAPK1及HGC-27-sh-MAPK1组显著低于相应阴性对照组（t分别为3.40和2.63，P＜0.01）。见图5。表明MAPK1下调可抑制SGC-7901及HGC-27细胞的迁移能力。

图5 细胞划痕愈合试验检测沉默MAPK1对GC细胞迁移能力的影响（×100）Fig.5 Cell healing test for migration ability of gastric cancer cells after silencing MAPK1（×100）

2.4.2 细胞Transwell小室试验SGC-7901-sh-MAPK1、SGC-7901-sh-Ctrl、HGC-27-sh-MAPK1及HGC-27-sh-Ctrl组迁移细胞数分别为76、200、75和206。SGC-7901-sh-MAPK1及HGC-27-sh-MAPK1组细胞迁移数显著少于相应阴性对照组（t分别为2.67和2.80，P＜0.01）。见图6。表明沉默MAPK1可降低SGC-7901及HGC-27细胞的纵向迁移能力。

图6 Transwell小室试验检测沉默MAPK1对CG细胞迁移能力的影响（×100）Fig.6 Transwell assay on migration ability of gastric cancer cells after silencing MAPK1（×100）

2.5 沉默MAPK1对CG细胞侵袭能力的影响SGC-7901-sh-MAPK1、SGC-7901-sh-Ctrl、HGC-27-sh-MAPK1及HGC-27-sh-Ctrl组侵袭细胞数分别为60、115、40和88。SGC-7901-sh-MAPK1及HGC-27-sh-MAPK1组侵袭细胞数显著少于相应阴性对照组（t分别为3.59和3.27，P＜0.01）。见图7。表明沉默MAPK1可降低SGC-7901及HGC-27细胞的侵袭能力。

图7 Transwell小室试验检测沉默MAPK1对CG细胞侵袭能力的影响（×100）Fig.7 Transwell assay on invasion ability of gastric cancer cells after silencing MAPK1（×100）

2.6 沉默MAPK1对CG细胞周期的影响SGC-7901-sh-MAPK1及HGC-27-sh-MAPK1组处于G1期的细胞比例显著高于相应阴性对照组（t分别为3.56和4.80，P＜0.01）；处于S期、G2期的细胞比例显著低于相应阴性对照组（t=-3.82~2.73，P＜0.01）。见图8和表1。表明MAPK1基因下调可使细胞滞于G1期，从而阻止细胞从G1期向S期发展，进而影响肿瘤细胞的增殖。

表1 各组CG细胞所处细胞周期的细胞数占比（%，±s，n=3）Tab.1 Proportions of gastric cancer cells at various cell phases in various groups（%，±s，n=3）

表1 各组CG细胞所处细胞周期的细胞数占比（%，±s，n=3）Tab.1 Proportions of gastric cancer cells at various cell phases in various groups（%，±s，n=3）

注：aa表示与相应阴性对照组比较，P＜0.01。

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2.7 沉默MAPK1对CG细胞凋亡能力的影响SGC-7901-sh-MAPK1、SGC-7901-sh-Ctrl、HGC-27-sh-MAPK1及HGC-27-sh-Ctrl组早期凋亡率分别为（3.17±0.003）%、（1.22±0.001）%、（12.04±0.007）%、（3.15±0.002）%，晚期凋亡率分别为（17.41±0.008）%、（0.20±0.000）%、（13.39±0.002）%、（1.05±0.001）%。SGC-7901-sh-MAPK1及HGC-27-sh-MAPK1组细胞早期及晚期凋亡率显著高于相应阴性对照组（t=0.000～12.340，P＜0.01）。见图9。表明MAPK1可显著提高SGC-7901及HGC-27细胞的凋亡能力，促进其凋亡。

图9 流式细胞术检测各组CG细胞的凋亡细胞数Fig.9 Flow cytometry of number of apoptotic gastric cancer cells in various groups

2.8 沉默MAPK1对CG细胞周期和凋亡相关分子表达的影响SGC-7901-sh-MAPK1及HGC-27-sh-MAPK1组细胞CDK6、P53、Bax、Caspase 3、C-Caspase 3、Caspase 9、C-Caspase 9表达明显高于相应阴性对照组（t=3.17～6.35，P＜0.01），CDK1、CCNB1及Bcl-2表达则明显低于相应阴性对照组（t=2.85～4.03，P＜0.01）。见图10和表2。表明MAPK1下调可使细胞滞于G1期，阻止细胞从G1期向S期发展，促进细胞凋亡。

图10 Western blot法检测各组CG细胞周期和凋亡相关分子的表达Fig.10 Western blotting of expression and cell cycle-and apoptosis-associated factors in gastric cancer cells in various groups

表2 CG细胞周期和凋亡相关分子的表达水平（±s，n=3）Tab.2 Expression levels of cell cycle-and apoptosis-associated factors in gastric cancer cells in various groups（±s，n=3）

表2 CG细胞周期和凋亡相关分子的表达水平（±s，n=3）Tab.2 Expression levels of cell cycle-and apoptosis-associated factors in gastric cancer cells in various groups（±s，n=3）

注：aa表示与相应阴性对照组比较，P＜0.01。

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图8流式细胞术检测各组CG细胞的细胞周期分布Fig.8 Flow cytometry of cell cycle distribution of gastric cancer cells in various groups

3 讨论

GC是一种死亡率较高的疾病，随着医疗技术的发展，癌症发病率稳步下降，但临床管理面临巨大挑战［13］。尽管人们对遗传和表观遗传癌症有了越来越多的了解，但缺乏用于早期诊断GC的非侵入性方法［14］。本研究应用TCGA数据库数据挖掘网站-UALCAN，提取GC患者基因表达及临床病理特征数据，统计结果表明，MAPK1在原发性肿瘤中的表达明显升高（P＜0.01），且在GC中的表达具有显著种族差异性（P＜0.01），非裔美国人和亚洲人中CG患者的MAPK1表达量相对较低，而高加索人GC患者的表达量较高；在肿瘤病理分级和分期中，MAPK1表达量在2、3级和2、3、4期明显升高（P＜0.05）。表明MAPK1是一个在GC中高表达，并具有临床相关性的癌基因。许多研究表明，miRNA可通过靶向调控MAPK1影响肿瘤的生长进展，如miR-585、miR-378、miR-454通过直接靶向MAPK1抑制CG细胞增殖、侵袭、转移等恶性生物学行为［9，15-16］；在对黑色素瘤的研究中，miR-524-5p靶向调控BRAF和ERK2抑制致癌性BRAF黑色素瘤的生长［17］；miR-217-5p可通过直接靶向PRKCI、BAG3、ITGAV和MAPK1诱导结直肠癌细胞凋亡［18］。

上述研究表明，MAPK1在GC的发生、发展中起着关键性作用，为探讨沉默MAPK1对CG细胞生物学行为的影响，本研究用慢病毒LV-sh-MAPK1感染SGC-7901及HGC-27细胞，使MAPK1在细胞中沉默表达。沉默MAPK1后能够显著抑制SGC-7901、HGC-27的增殖、迁移及侵袭能力（P＜0.01）；可明显诱导CG细胞的凋亡（P＜0.01），且细胞被阻滞于G1期；调控细胞G1期的CDK6的表达量明显上调（P＜0.01），而调控细胞G2、G2／M期的CDK1、CCNB1的表达量显著下调（P＜0.01）；促进细胞凋亡的Bax、Caspase 3、C-Caspase3、Caspase 9、C-Caspase 9基因的表达明显升高（P＜0.01），而抑制细胞凋亡的Bcl-2基因的表达则明显降低（P＜0.01）。

综上所述，沉默MAPK1可抑制人CG细胞增殖、侵袭迁移能力，促进细胞凋亡并将其阻滞在G1期。因此，MAPK1可能被作为一种有价值的基因治疗靶点用于GC的治疗。