流感嗜血杆菌D蛋白作为A群脑膜炎奈瑟菌多糖蛋白结合疫苗蛋白载体的免疫效果评价

王丽婵，谭亚军，卫辰，张庶民，张华捷，马霄

中国食品药品检定研究院百白破疫苗与毒素室卫生部生物技术产品检定方法及其标准化重点实验室，北京102629

带有荚膜多糖的细菌如流感嗜血杆菌、脑膜炎奈瑟球菌、肺炎链球菌等，是严重威胁人类健康的几种侵袭性呼吸道细菌，对5岁以下儿童尤其是2岁以下婴幼儿和70岁以上老年人是主要的致命性病原菌。细菌多糖存在于细菌表面，在细菌感染过程中起关键作用。多糖提取后即可作为疫苗预防细菌感染，细菌多糖疫苗对肺炎链球菌、流行性脑膜炎球菌、b型流感嗜血杆菌等多种细菌引起的传染病具有显著的预防效果，但多糖疫苗也有其自身的一些缺点，如多糖抗原为T细胞非依赖型（T cell independent，TI），使其在免疫系统发育尚未完全的2岁以下儿童中免疫效果极不理想，对于免疫缺陷人群及65岁以上老年人的保护性也较差［1-2］。目前通用的解决方案是使用化学方法将细菌多糖与某个能够引起T细胞免疫反应的载体蛋白偶联制备多糖蛋白结合疫苗，从而实现抗原类型从TI到T细胞依赖型（T cell dependent，TD）的转化，解决婴幼儿接种多糖疫苗无免疫应答、低免疫应答和不能产生长期保护的问题。

目前常用的载体种类有限，包括白喉类毒素（diphtheria toxoid，DT）、破伤风类毒素（tetanus toxoid，TT）以及白喉毒素突变体CRM197等，其中TT的免疫原性及免疫持久性最好，这也是目前已上市的多糖-蛋白结合疫苗使用的主要载体。随着多糖结合疫苗种类的增多，载体蛋白的开发跟不上多糖结合疫苗的发展，势必出现相同载体蛋白同时应用于几个多糖结合疫苗的情况，将会引起争夺体内有限的载体蛋白特异性T淋巴细胞的现象，从而影响免疫效果。此外，TT本身为百白破联合疫苗中破伤风疫苗的成分，重复接种有增加TT接种量的风险，很可能会引起超负荷或免疫抑制等问题［3-4］。因此，进一步开展对载体蛋白的研究和开发一系列有效的载体蛋白势在必行。

流感嗜血杆菌D蛋白（protein D，PD）是流感嗜血杆菌的外膜蛋白成分，也是其毒力因子之一，作用于宿主的呼吸系统，为流感嗜血杆菌在鼻咽部的定居提供可能［5］。PD相对分子质量约为42 000，几乎存在于所有流感嗜血杆菌中，因其能与人类免疫球蛋白D结合而命名［6］。以PD为载体的结合疫苗在国外早有研究，并已有产品上市，如葛兰素史克公司研制的10价肺炎球菌结合疫苗，经多项临床评价，显示其免疫原性及安全性良好，既能提高肺炎球菌多糖的免疫原性，又能通过产生的D蛋白特异性抗体在一定程度上预防流感嗜血杆菌感染引起的疾病，如中耳炎［7-15］。本研究旨在对流感嗜血杆菌PD为载体蛋白的A群脑膜炎奈瑟菌（group A meningococcal polysaccharide，GAMP）结合物进行初步免疫效果评价。

1 材料与方法

1.1 主要试剂及仪器 重组PD为本室前期自行制备保存；TT蛋白和GAMP多糖由中国食品药品检定研究院呼吸道细菌室提供；A群脑膜炎球菌多糖由北京卫信天成公司提供；HRP标记的羊抗鼠IgG、IgG1和IgG2a为美国Santa Cruz公司产品；小鼠淋巴细胞分离液、无血清细胞培养液和细胞因子检测试剂盒为深圳达科为公司产品；RPMI1640培养液为美国Hyclone公司产品；OPD显色试剂为美国Ameresco公司产品；PMA、Ionomycin、FHA、DMF、TTC和DMSO为美国Sigma公司产品；Mouse CD3 PerCP、Mouse CD4 FITC、Mouse IFNγ PE、Mouse IL-4 APC和Brefeldin A为美国Biolegend公司产品；Sepharose 4FF凝胶层析柱为美国GE公司产品；酶标仪为美国Molecular Devices公司产品；ELISPOT检测分析仪为美国CTL公司产品；流式检测分析仪为美国Becton Dickinson产品；细胞计数仪为日本Celltac公司产品；圆形底组织培养微量滴定板和ELISA酶标板为美国Costar公司产品；圆形、方形培养皿为美国Nunc公司产品；其他试剂均为国产分析纯。

1.2 实验动物SPF级BALB／c小鼠，雌性，4周龄，体重16～18 g，由中国食品药品检定研究院实验动物中心提供。实验动物生产许可证号：SCXK（京）2014-0013。

1.3 多糖-蛋白结合物的制备 蛋白与多糖以CDAP活化法结合［16-17］，该方法可在弱碱性条件下完成，减少由于强碱条件对多糖结构或抗原表位的破坏。此外，CDAP活化法可不需使用连接臂直接将活化的多糖与载体蛋白相连。结合物经Sepharose 4FF凝胶层析柱纯化后，用0.22 μm滤器除菌过滤，2～8℃储存备用。

1.4 多糖-蛋白结合物理化性质检测 参照《中国药典》三部（2015版）［18］，结合物中蛋白质含量采用改良Lowry法测定；A多糖含量采用磷测定法进行折算，根据二者的含量计算多糖／蛋白比值。

1.5 多糖-蛋白结合物的动物免疫 将小鼠随机分为6组：A群脑膜炎球菌多糖组（GAMP）、GAMP-PD结合物组、PD组、GAMP-TT结合物组、TT蛋白组和阴性对照组（生理盐水组），每组12只，经腹部皮下接种。单独多糖组按多糖含量5 μg／mL免疫，单独蛋白组按蛋白含量10 μg／mL免疫，多糖-蛋白结合物组按多糖含量5 μg／mL免疫，免疫剂量为0.5 mL／只。共免疫3次，第1、10、20日免疫，分别于第9、19、27天眼眶采血，分离血清，-20℃保存备用。

1.6 多糖-蛋白结合物的免疫效果评价

1.6.1 小鼠血清抗多糖特异性IgG、IgG1、IgG2a的检测 采用间接ELISA法检测各组小鼠免疫后血清中A群多糖特异性IgG、IgG1、IgG2a抗体水平及第3针免疫后IgG1和IgG2a抗体亚类。用终浓度3 μg／mL的GAMP多糖包被酶标板，4℃过夜；洗板3次，加入按一定比例稀释的待检小鼠血清，37℃孵育1 h；洗板6次，加入相对应的羊抗鼠IgG、IgG1、IgG2a，37℃孵育1 h；洗板6次，加入OPD显色，2 mol／L硫酸终止显色，酶标仪读取A490值。以试验组A490值≥PBS对照组A490值的2.1倍为抗体滴度。

1.6.2 小鼠血清抗蛋白特异性IgG、IgG1、IgG2a的检测 采用间接ELISA法检测各组小鼠免疫后血清中载体蛋白特异性IgG、IgG1、IgG2a抗体水平及第3针免疫后IgG1、IgG2a抗体亚类。方法同1.6.1项，包被抗原为TT和PD。以试验组A值≥PBS对照组A值的2.1倍为抗体滴度。

1.6.3 细胞因子IFNγ和IL-4的检测 采用ELISPOT法。取各组第3次免疫7 d后小鼠6只，按照ELISPOT试剂盒说明，取小鼠脾脏，分离脾淋巴细胞，检测IFNγ和IL-4。每只小鼠均设复孔及不加刺激物的对照孔。对于同一结合组小鼠，分别给予不同免疫成分的刺激，即相应蛋白、多糖及蛋白多糖混合物，以便更直观地观察小鼠在接受不同成分刺激物刺激时产生细胞因子的变化情况。刺激物孔内终浓度除PD为10 μg／mL外，多糖为30 μg／mL，阳性刺激物ConA终浓度为100 ng／mL，阴性对照孔为PBS。试验孔最终斑点形成细胞（spot forming cell，SFC）数为试验孔SFC-未加刺激物的对照孔SFC，复孔取平均值。

1.6.4 Th1和Th2细胞亚群检测 采用流式细胞术检测小鼠免疫后脾淋巴细胞在体外经非特异性刺激剂刺激后，其本身Th1和Th2细胞状态的变化。试验结果以Th1／Th2细胞亚群比值显示。

1.7 统计学分析 采用IBM SPSS Statistics 20进行统计学分析。组间比较采用单因素方差分析和t检验，Kolmogorov-Smirnov法检验数据的正态性。检验水平：α=0.05，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 多糖-蛋白结合物的理化性质GAMP-PD的多糖／蛋白比值为1.64，GAMP-TT的多糖／蛋白比值为0.47，见表1。

表1多糖-蛋白结合物理化性质检测结果Tab.1 Test results of physical and chemical properties of polysaccharide-protein conjugates

2.2 多糖-蛋白结合物的免疫效果

2.2.1 小鼠血清抗多糖特异性IgG、IgG1、IgG2a抗体水平及亚类GAMP-PD和GAMP-TT组每次加强免疫后，均能增强抗-GAMP抗体的IgG水平。与GAMP组相比，接种3针后，GAMP-PD和GAMP-TT组抗-GAMP IgG水平均显著升高（t=5.242，P=0.000 1），且产生免疫记忆，诱导IgG1、IgG2a的产生。见表2。

表2 各组小鼠血清抗-GAMP IgG抗体水平及亚类Tab.2 Anti-GAMP IgG levels and subclasses in sera of mice of various groups

2.2.2 小鼠血清抗蛋白特异性IgG、IgG1、IgG2a抗体水平及亚类GAMP-PD和PD组抗-PD IgG水平在各针次之间均有显著增长；接种3针后，PD组抗-PD IgG和IgG1显著高于GAMP-PD组（t=4.097，P=0.025）。TT组在各针次之间均有显著增长。GAMPTT组各针次的抗-TT IgG抗体均未检出。见表3。表明PD、TT蛋白与A群多糖结合后，其自身免疫原性受到不同程度的抑制，尤其是TT与A群多糖结合后，TT的免疫原性完全受到抑制。

表3 蛋白及蛋白与A群多糖结合组免后抗-蛋白抗体IgG及其亚类的检测Tab.3 Anti-PD IgG and anti-TT IgG levels and subclasses of mice after immunization with protein or conjugate of protein and group A meningococcal polysaccharide

2.2.3细胞因子IFNγ和IL-4产生情况PD与多糖结合诱导产生的细胞因子SFC数量高于TT与多糖结合；总体来看，与单独多糖组相比，各多糖蛋白结合组在受相应刺激后均能诱导产生IFNγ和IL-4，激发细胞免疫与体液免疫反应。与GAMP-TT组相比，GAMP-PD组诱导的IFNγ SFC数量更高（F=7.853，P=0.026）。见图1。

图1 GAMP与各蛋白结合组免疫后小鼠体外经不同刺激物刺激后的细胞因子产生情况Fig.1 Production of cytokines in mice immunized with conjugates of GAMP and various proteins after stimulation with different stimuli in vitro

2.2.4 小鼠脾细胞Th1和Th2亚群分析 与阴性对照组相比，GAMP-PD和GAMP-TT组的Th1／Th2比值大部分显著升高（F=56.136，P分别为0.009和0.001）；与GAMP与GAMP-PD组相比，差异无统计学意义（F=17.389，P=0.507），但GAMPTT组显著高于多糖组（F=17.389，P=0.01）。见表4。

表4 各组小鼠体外脾淋巴细胞Th1／Th2细胞亚群比值Tab.4 Ratios of Th1／Th2 subsets in spleen cells of mice in various groups

3 讨论

细菌的荚膜多糖为TI抗原，具有多个重复的B细胞表位，免疫原性弱，直接激活B细胞产生抗体，无需Th细胞的辅助。TI抗原刺激B细胞产生的体液免疫应答一般不发生抗体同种型转换，仅产生IgM类抗体，且无免疫记忆，不能刺激T细胞产生细胞免疫应答［19］。这些缺点使细菌多糖疫苗的应用受到限制，为此，研究者将蛋白载体与多糖通过化学方式结合，使多糖的TI抗原性质转变为TD抗原，既能激活B细胞，又能激活T细胞，且具有免疫记忆。本文主要研究以流感嗜血杆菌PD作为脑膜炎球菌多糖疫苗蛋白载体的可行性。

本研究中蛋白与多糖的活化方法为1-氰基-4-二甲氨基-吡啶四氟硼酸（1-cyano-4-dimethylamino pyridinium tetrafluoroborate，CDAP）法。此方法最大的优点是可使反应在更温和的条件下进行，反应的pH条件较溴化氰活化法范围更广，可在弱碱性条件下完成，减少强碱条件下对多糖结构或抗原表位的破坏。此外，CDAP活化法可不需使用连接臂直接将活化的多糖与载体蛋白相连［16-17］。

PD显著增强与之结合的多糖的免疫原性，对A群多糖的免疫增强作用较明显。A群多糖与PD和TT蛋白结合组均检测到IgG1和IgG2a，且前者显著高于后者；而单独GAMP组IgG1和IgG2a的A值均低于PBS对照组A值的2.1倍。表明PD与A群多糖结合后能显著增强多糖的免疫原性，产生免疫记忆，抗体类型发生转换，与GAMP-TT组相比，差异无统计学意义（P＜0.05）。抗蛋白抗体检测结果显示，与单独蛋白组比较，蛋白与A群多糖结合后，其自身免疫原性均受到一定程度的限制，尤其TT蛋白抗体，几乎检测不到，这种现象在文献中也有报道［20-21］。表明对某些蛋白来说，与多糖结合后会或多或少抑制蛋白的免疫原性，可能在结合过程中多糖遮盖了蛋白的抗原表位［22-23］；也可能是蛋白在与多糖结合时发生了构象变化，使免疫原性减弱；对于TT来说，还有一种可能是TT在化学脱毒过程中破坏了T细胞表位，影响其免疫原性［24］，具体原因尚需确证。

ELISPOT细胞因子检测结果提示，PD与多糖的结合能激活机体的细胞免疫反应，但流式检测Th1／Th2比值与单独多糖组相比，差异无统计学意义（P＞0.05），流式细胞术与ELISPOT技术相比，其敏感性相对较差，有待于进一步实验确证。

综上所述，PD与多糖结合后能增强多糖的免疫原性，使其由TI抗原转换为TD抗原，诱导抗体类型发生转换，产生免疫记忆，提高了体液免疫反应的能力，又能激发细胞免疫反应，提示PD具备作为脑膜炎奈瑟菌多糖蛋白载体应用的潜力。