高效液相色谱法测定朝伦·细莫-21 散中栀子苷的含量

魏颖轩，包冉，王伟，张跃翔，崔园园，张冬梅

（1 包头市食品药品检验检测中心，内蒙古 包头；2 内蒙古盛唐国际蒙医药研究院，内蒙古 呼和浩特）

0 引言

朝伦·细莫-21 散由沙棘、栀子[1]、人工牛黄等21 味药组成。临床功效为袪“宝日”病。用于“宝日”病，在发病的初期及中期患者往往表现为嗳气、胸背部有疼痛感、气滞血瘀等。栀子的主要功效为清热去火、利湿除烦。在标准制定过程中,以栀子苷作为测定指标[2],参照《中国药典》2015 年版一部[3]“栀子”项下含量测定方法，使用的测定方法为高效液相色谱法，对该药中的栀子苷含量进行有效的测定。在实验的不断研究中确定了理想的色谱条件，并进行考察及对照实验最终得出，该方法具有较强的专属性和重现性，且操作起来十分方便，药方中的其他成分在测定的过程中并没有对栀子苷造成干扰。

1 仪器与试药

1.1 仪器

U3000 型高效 液相色谱仪；SCL-10AvP 型控制器,SPD-10AvP 型检测器，Class-vP 色谱工作站，岛津UV-1700 型紫外-可见分光光度仪；隔膜真空泵（巩义市英峪仪器厂）；KQ-250DB 型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；Heal Force NW15UV 型超纯水系统；ADVENTURERTM 型电子天平（万分之 一）；Ohaus Discovery 型电子天平（十万分之一）；FW400A 型多功能粉碎机（材茂科技有限公司）。

1.2 试剂与试药

栀子苷对照品（批号：110749-201617），由中国食品药品检定研究院提供；供试品三批（批号：20190928，20190938，20190948），由国际蒙医医院提供，自制样品一批（20190917）；乙腈为色谱纯，水为超纯水，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Alltima C18柱(250mm×4.6 mm,5μm)；柱温：33 ℃；检测波长：238nm；流速：1.0ml/min；进样量：10μl；流动相：乙腈-水 (15 ∶85)；理论塔板数不低于1500。

2.2 溶液的制备

对照品溶液：在精密的条件下称取出栀子苷对照品，称取量为14.68mg，将其放置在100ml 的量瓶中，并加入甲醇进行溶解处理，稀释到一定刻度时将溶液摇匀，吸出5ml后将其放置在10ml 的量瓶中，加入甲醇继续稀释处理，将其稀释到刻度，配置成含栀子苷质量浓度为73.4μg/ml 的对照品溶液。

供试品溶液：取大约0.5g 本品进行精密称定后将其放置到锥形瓶中，加入50ml 甲醇，称定其重量后使用超声进行0.5h 的处理，将功率设置为250W，将频率设置为40kHz，冷却后继续称重，减失的重量使用甲醇进行补足处理，之后将溶液摇匀后进行过滤即得供试品溶液。

阴性对照品溶液：按照一定的处方比例称取出其余药材，按照一定的生产工艺将缺栀子的阴性样品进行制备，阴性对照品溶液制备方法同于供试品溶液[4,5]。

2.3 方法学考察

专属性试验：分别精密吸取对照品溶液、阴性对照溶液、供试品溶液各10µl,在拟定的色谱条件下注入液相色谱仪，测得的结果显示阴性对照色谱中，与栀子苷对照品、供试品色谱相应的保留时间并没有色谱峰出现，这就说明其他的组分并没有对栀子苷的测定造成干扰。

2.4 线性关系考察

精密吸取对照品溶液1μl、3μl、5μl、7μl、10μl、12μl、15μl、20μl 分别进样,色谱条件按照以上标准，对栀子苷的进样量以峰面积进行回归分析，结果测得栀子苷呈现良好线性关系的范围为0.0734-1.4680μg。回归方程：Y=18.423X+0.0782,R2=1。

稳定性试验：取同一份供试品（批号：20190914）溶液，分别于0h、2h、4h、8h、12h、24h 进样测定。栀子苷在24h 内的峰面积积分值基本稳定不变，能够满足测定所需要的时间[6]。

精密度试验：取同一份供试品（批号：20190914）0.5058g，按拟定方法操作，连续进样6 次对栀子苷的峰面积积分值进行测定，RSD 为0.66%，这表明仪器具有良好的精密度。

重复性试验：取同一批号供试品（批号：20190914）6份，各约0.5g，精密称定，分别按拟定方法操作，测定每份供试品含量。结果表明，供试品在相同的细度、提取溶剂和色谱条件下，测定结果稳定。

加样回收率试验：取供试品（批号：20190914）9 份,均约0.25g,精密地称取，并在1、2、3 号中加入配置的栀子苷对照品溶液，加入量均为5ml，4、5、6 号则分别加入上述的对照品溶液，加入量均为10ml,7、8、9 号也加入上述对照品溶液，加入量均为15ml,分别按拟定方法操作,测定每份供试品含量,计算回收率,平均加样回收率为105.17%，RSD 为 1.89%。

耐用性试验：换不同厂家、不同型号的色谱柱，取供试品（批号：20190914）约0.5g，按拟定方法操作并测定含量，结果见表1。

表1 不同色谱柱的耐用性试验

说明本方法，在使用不同型号或厂家的色谱柱时，对测定结果影响较小，具有较好的耐用性。

2.5 样品含量测定

取3 批样品（批号：20190901,20190902,20190903）及自制样品（批号：20190914）约0.5g，各2 份，精密称定，按拟定方法处理并测定，含量测定结果见表2。

表2 样品中栀子苷的含量测定结果

3 讨论

3.1 检测波长的选择

取栀子苷对照品溶液，使用紫外可见分光光度仪，选择好波长，以200-700nm 范围做光谱扫描，其中出现最大吸收的波长为238nm 处，同时在该处的峰形及峰高是最合适的，因此将238nm 作为最佳的检测波长[7，8]。

3.2 流动相的选择

参照《中国药典》2015 年版一部[3]栀子项下，以乙腈-水（15 ∶85）作为流动相进行测定，测定的结果提示栀子苷峰具有较好的分离效果，阴性对照品无干扰，并具有较适合的保留时间。

3.3 提取时间的考察

参考《中国药典》2015 年版一部[3]“栀子”项下，以甲醇作为提取溶剂进行超声处理（功率250W，频率40kHz），试验中考察了超声20min、30min、40min 等不同提取时间对提取效率的影响，通过考察得出，超声处理30min 时，在供试品中提取栀子苷的含量最高，故将提取时间定为30min。

3.4 栀子药材的转移率

取栀子药材粉末约0.05g，精密称定，按《中国药典》2015 年一部[3]“栀子”项下的方法处理并测定，栀子药材中栀子苷的含量测定结果见表3。

表3 栀子药材中栀子苷的含量测定结果

从表2 中数据可见,自制样品（20190914）中栀子苷的含量为1.7270mg/g,从表3 数据可见,自制样品所用栀子药材的含量为30.4108mg/g,根据本品处方量折算,理论上成品每1g 含栀子苷应为1.63mg,因此转移率为1.73（mg/g）/1.63（mg/g）×100%=106.13%。