高效液相色谱法测定吉如和米斯-5 丸中胡椒碱含量

杨宇慧，周智臣，王晓东，宝山，那松巴以拉，青松，成志平

（1 包头市食品药品检验检测中心，内蒙古 包头；2 内蒙古国际蒙医医院，内蒙古 呼和浩特）

0 引言

吉如和米斯-5 丸是一种复方制剂，由五味药（荜茇、肉豆蔻、木香、丁香、广枣等）组成，用于心烦失眠，心神不安。有研究表明，荜茇对癌症、糖尿病、炎症和肥胖症等有较好的疗效[1,2]。此外，荜茇还有心脏保护、抗辐射所致的损伤和抗感染作用。参考文献[3]及相关研究将胡椒碱作为荜茇的质量控制指标[1，2]。本研究中采用高效液相色谱（high performance liquid chromatography,HPLC）法 测定吉如和米斯-5 丸中胡椒碱含量，以提高其质量标准[3-7]。

1 仪器与试药

1.1 仪器

岛津LC-10A 液相色谱仪（包括SPD-10A 型检测器，CLASSVP 色谱工作站；VU-2201 紫外可见分光光度计）；AE163 电子天平；AE100 电子天平。

1.2 试剂与试药

胡椒碱对照品（批号：110775-201706，纯度98.9%）中国食品药品检定研究院；样品由内蒙古国际蒙医医院提供（批号分别为201900607、20190948、20200124）。甲醇为色谱纯，水为超纯水，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶，本实验采ODS-2HYPERSIL（250mm×4.6mm，5μm）。柱 温30 ℃；检测波长343nm；流速1.0ml/min；进样量10μl；流动相：甲醇-水（70 ∶30）。

2.2 溶液制备

对照品溶液：精密称取胡椒碱对照品15.78mg，置50ml 棕色量瓶中，加无水乙醇使溶解，用无水乙醇稀释至刻度，摇匀，精密吸取3ml，置25ml 棕色量瓶中，用无水乙醇稀释至刻度，配置成含胡椒碱质量浓度为37.46μg/ml的对照品溶液。

供试品溶液：取本品适量，研细，取约0.8g，精密称定，置50ml 棕色量瓶中，加无水乙醇40ml，超声处理30min，放冷，加无水乙醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

阴性对照品溶液：按样品处方比例，称取缺荜茇的其余药材，并按生产工艺制备缺荜茇的阴性样品，按供试品溶液制备方法制备缺荜茇的阴性对照品溶液。

2.3 方法学考察

专属性试验：准确吸取上述溶液各10μl，根据色谱条件进样测定，记录色谱图。结果供试品溶液色谱图中，在与对照品溶液色谱相应位置上有相同保留时间的色谱峰，而阴性对照无干扰，表明专属性良好。见图1。

图1 高效液相色谱图

线性关 系考察：精密吸 取1μl、2μl、4μl、6μl、8μl、12μl、20μl 进样，按上述色谱条件进行测定，以胡椒碱质量（X）为横坐标、峰面积（Y）为纵坐标。绘制标准曲线，得胡椒碱回归方程Y=9 456.847015X-5 350.703684（R2=0.99999）。表 明，胡椒碱 在37.46-749.20ng 范围内呈良好的线性关系。

精密度试验：精密吸取（批号：20190607）供试品溶液10μl，按上述色谱条件连续进样6 次，胡椒碱峰面积的RSD 为0.5%，说明仪器精密度良好。

稳定性试验：取同一批（批号：20190948）样品，依法制备供试品溶液，分别于0h、4h、8h、12h、24h 时按拟订色谱条件进样测定。结果胡椒碱峰面积的RSD 为0.1%(n=5)，表明供试品溶液24h 内稳定性良好。

重复性试验：取同一供试品（批号20190607）6 份，按正文供试品制备方法制备样品，照HPLC 法（《中国药典》2015 年版四部通则0512），在343nm 波长处测定峰面积，按外标峰面积计算。测定每份样品的含量，RSD%为1.7%，表明该方法重现性良好。

准确度试验：加样回收试验，取供试品（批号20190607，含量0.4994mg/g）6 份，按已知量的100%加入胡椒碱对照品，按正文供试品制备方法制备样品，照HPLC法（《中国药典》2015 年版四部通则0512），在343nm 波长处测定峰面积，按外标峰面积计算。结果胡椒碱平均回收率为97.0%，RSD 为0.86%。

耐用性试验换不同厂家、不同型号的色谱柱，取供试品（批号：20190607）精密称定，按正文供试品制备方法制备样品，照HPLC 法（《中国药典》2015 年版四部通则0512），在343nm 波长处测定峰面积，按外标峰面积计算，测定含量，RSD%为0.5%。

2.4 样品含量测定

样 品(批号分别为201900607、20190948、20200124)，依法制备供试品溶液，分别进样10μl，按拟订色谱条件进样测定，计算样品中胡椒碱的含量。结果3 批样品中胡椒碱含量分别为0.523mg/g、0.499mg/g、0.534mg/g，平均含量为0.519mg/g。

3 讨论

3.1 检测波长选择

取胡椒碱对照品溶液，于紫外可见分光光度仪上，自200-700nm 波长内做光谱扫描，胡椒碱在波长为343nm处有最大吸收，且在343nm 波长处得到的峰形、峰高最适宜，故选择343nm 作为检测波长[8-10]。

3.2 流动相选择

参照文献[3]荜茇项下，以甲醇-水（77 ∶23）作为流动相进行测定，结果胡椒碱峰保留时间短，分离效果不好，当将流动相比例调整为甲醇-水（70 ∶30）时，样品中的胡椒碱具有更好的分离度和更长的保留时间[11,12]。

3.3 提取溶剂和提取时间确定

按照文献[3]中荜茇含量的测定方法，通过超声提取无水乙醇制备待测溶液。为了充分提出要测量的组分，本研究调查了在超声处理20min、30min、40min 时的同一批样品中待测量成分的含量随时间的变化。结果表明，在30min 和40min 时，待测成分的含量没有显著变化。因此，超声处理时间确定为30min。

3.4 方法评价

结果表明：对于本研究而言，HPLC 法高效、准确、可靠，所选指标成分与制剂的主要药味和功能主治接近，可为完善吉如和米斯-5 丸的质量控制提供参考[8]。