近红外光响应性复合纳米颗粒介导光热消融与自由基生成用于乳腺癌细胞的联合治疗

张静静，徐丽霞，刘苏婉，刘劲静，杜凤移，张礼荣

(江苏大学医学院， 江苏 镇江 212013)

肿瘤光热治疗是一种新兴的局部肿瘤消融技术，其原理是使用热敏剂将外源近红外光能转换为热能，进而导致肿瘤发生不可逆的损伤[1-2]，具有潜在的临床应用前景[3-4]。传统的治疗手段主要有手术切除，化疗和放疗，但都存在一定的局限性，如手术切除创伤较大、化学疗法不良反应较大，易耐药；放射疗法缺乏特异性，易引起系统毒性等。而光热治疗具有非侵入性，微创，精确可控和可重复治疗等优势，使用可调节的外部近红外激光照射可以精确定位肿瘤，从而迅速有效地消融肿瘤而对周围健康组织的损伤最小[5]。其中，聚多巴胺是一种由多巴胺在弱碱性环境下自聚合而得的贻贝仿生类材料，因其具备优良的近红外光热转换功能而广泛应用于肿瘤的光热治疗。尽管如此，光热治疗也存在一定局限性，单一的光热治疗并不能完全消融肿瘤，残留的微小肿瘤会引起致命性的肿瘤复发和转移。

细胞毒性自由基是一类能有效诱导癌细胞坏死或凋亡的活性物质[6]。其中，基于活性氧自由基的化学动力疗法，已广泛用于癌症放疗[7-8]、化疗[9-10]和声动力疗法[11]。研究已经证明，化学动力疗法利用过量的活性氧自由基可引起肿瘤细胞发生不可逆的损伤，进而显著抑制肿瘤的生长。然而，肿瘤的低氧微环境在很大程度上降低了活性氧自由基的治疗效果[12-13]。2,2-偶氮双[2-(2-咪唑啉-2-基)丙烷]二盐酸盐(AIPH)是一种可在光照和加热刺激下迅速解离释放对细胞有毒性的烷基自由基的水溶性化合物[14]。由于不需要氧气供应，基于AIPH的化学动力疗法有望克服肿瘤的深层低氧微环境并实现肿瘤的完全消融[15-16]。基于上述分析，本研究拟将化学动力疗法与光热治疗相结合，设计出负载AIPH的聚多巴胺纳米颗粒(AIPH@PB NPs)用于乳腺癌细胞的治疗。

1 材料与方法

1.1 主要试剂、仪器与细胞

血清白蛋白、多巴胺和AIPH均购自上海阿拉丁试剂公司；胎牛血清、DMEM和改良的RPMI培养基均购自美国Hyclone公司；冷冻干燥机(北京博医康实验仪器有限公司)；808 nm激光器(北京镭志威光电技术有限公司)；A560双光束紫外可见分光光度计(上海翱艺仪器有限公司)；热成像摄像机(东莞新泰仪器有限公司)；CCK-8试剂盒(北京索莱宝科技有限公司)；酶标仪(美国伯乐公司)；小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)和小鼠乳腺癌细胞(4T1)均购自中科院上海细胞研究所。

1.2 制备AIPH@PB NPs

称取20 mg血清白蛋白、2 mg AIPH和10 mg多巴胺，溶解于20 mL去离子水中，室温下持续搅拌1 h，溶液从透明变为棕黑色。将棕黑色溶液于25 ℃ 2 000 r/min离心15 min；取上清液于透析袋中透析并经冷冻干燥机冻干，得到的棕黑色粉末即为AIPH@PB NPs。

1.3 表征AIPH@PB NPs的理化性质

利用马尔文粒度分析仪表征其粒径大小；利用X射线衍射能谱分析其晶体或非晶体结构；利用傅里叶红外光谱表征其化学结构；利用X射线光电子能谱表征其元素组成。

1.4 检测AIPH@PB NPs 的光热效能

将AIPH@PB NPs 配成不同浓度(1.0、1.5、2.0、2.5 mg/mL)水溶液，先用紫外可见分光光度计检测其在808 nm处光密度(D)值，然后以去离子水作为对照，用1.5 W/cm2功率密度的808 nm近红外激光照射不同浓度AIPH@PB NPs水溶液10 min，观察温度变化。另外，在AIPH@PB NPs水溶液浓度为2.0 mg/mL时，观察不同功率密度(1.0、1.5、2.0 W/cm2)下温度的变化。每隔30 s记录温度变化的数值。并且根据其下降曲线(2.0 mg/mL，1.5 W/cm2)，计算其光热转换效率。为探究 AIPH@PB NPs的光热再生性和稳定性，将2.0 mg/mL水溶液置于1.5 W/cm2的 808 nm 近红外激光照射下进行4次加热-冷却循环。

1.5 紫外可见分光光度法检测烷基自由基的产生

将0.1 mL AIPH@PB NPs(2.0 mg/mL)与0.1 mL 1,3二苯基异苯并呋喃(DPBF，1 mg/mL) 混合后在功率密度为 1.5 W/cm2的808 nm近红外激光下照射不同时间，然后用紫外可见分光光度计检测其在425 nm处D值。

1.6 CCK-8实验检测细胞活力

将1×104个小鼠胚胎成纤维细胞MEF和小鼠乳腺癌4T1细胞分别接种于96孔板中，在37 ℃、5% CO2培养箱中孵育24 h后，加入不同浓度的AIPH@PB NPs(0、10、25、50、100、200、400、800 μg/mL)孵育48 h；再加入CCK-8试剂并使用酶标仪测定细胞的相对存活率。另外，为了检测光照下不同浓度AIPH@PB NPs对细胞活力的影响，将经过不同浓度AIPH@PB NPs孵育的细胞置于808 nm激光下照射5 min后继续在37 ℃、5% CO2培养箱中孵育24 h，最后通过CCK-8法测定细胞活力。酶标仪测定在波长450 nm处各孔的D值，根据以下公式计算细胞活力：细胞活力(%)=(实验组D值-空白组D值)/(对照组D值-空白组D值)×100 %，实验独立重复3次。其中实验组加入细胞、AIPH@PB NPs和CCK-8溶液；空白组只加入CCK-8溶液；对照组加入细胞和CCK-8溶液。

1.7 统计学分析

2 结果

2.1 AIPH@PB NPs的合成及理化表征

AIPH@PB NPs的合成路径见图1A。马尔文粒度分析仪结果(图1B)显示，制备的AIPH@PB NPs粒径呈正态分布，约为165 nm。AIPH@PB NPs水溶液在室温下分散均匀且无明显沉淀。X射线衍射能谱图表明，在20°处有较宽的衍射峰，代表AIPH@PB NPs为非晶相结构(图1C)。利用傅里叶红外光谱表征其化学结构(图1D)，结果显示在3 413 cm-1，1 602 cm-1和1 000 cm-1处出现3个很明显的峰，分别对应C-OH、C=O和酰胺基团(-NHCO-)。此外，利用X射线光电子能谱表征AIPH@PB NPs的元素组成。由图1E可以看出在287 eV、400 eV、532 eV和655 eV处显示4个峰，表明AIPH@PB NPs由碳、氮、氧和锰等4种元素组成。

2.2 AIPH@PB NPs的光热性能

利用紫外可见分光光度计检测不同浓度的AIPH@PB NPs在808 nm处的D值，结果显示，AIPH@PB NPs在808 nm处的D值呈现明显的浓度依赖性(图2A)。然后研究在1.5 W/cm2功率密度下不同浓度AIPH@PB NPs溶液的温度变化。如图2B显示，溶液温度随着浓度的增加而升高，而对照组在同等照射条件下温度无明显变化。然后固定浓度2.0 mg/mL，研究不同功率密度下AIPH@PB NPs液的温度变化。如图2C所示，溶液温度随着功率密度的增加而升高。最后选取2.0 mg/mL AIPH@PB NPs在1.5 W/cm2下照射10 min得到如图2D所示的光热曲线图，并根据其下降曲线获得冷却阶段的时间与-Ln/θ的线性关系(图2E)。根据公式计算出光热转换效率为31%。另外，利用激光开/关4个循环周期对AIPH@PB NPs的光热稳定性进行研究。如图2F所示AIPH@PB NPs在4个周期内光热稳定性良好，光热效果随着光照次数的增加而保持稳定。以上实验结果说明，AIPH@PB NPs具有良好的光热转换能力和光热稳定性。

2.3 AIPH@PB NPs产生烷基自由基能力

自由基引发剂AIPH为热敏性分子，可在加热条件下分解生成具有较强活性的烷基自由基，而烷基自由基可在无氧条件下破坏多种细胞成分。本研究中，利用DPBF作为指示剂测量烷基自由基的产生。随着照射时间的延长，溶液中425 nm处D值逐渐下降，说明不断产生烷基自由基(图3)。

A：AIPH@PB NPs的合成路线；B：AIPH@PB NPs的粒径分布图；C：AIPH@PB NPs的X射线衍射能谱图；D：AIPH@PB NPs的傅里叶红外光谱图；E：AIPH@PB NPs的X射线光电子能谱图

A：AIPH@PB NPs的紫外可见吸收光谱图；B：AIPH@PB NPs在不同浓度下的光热曲线图；C：AIPH@PB NPs在不同功率密度下的光热曲线图；D：用1.5 W/cm2近红外激光处理AIPH@PB NPs溶液600 s并冷却下来的光热曲线图；E：从图D冷却阶段获得的时间与-Ln/θ的线性关系图；F：AIPH@PB NPs溶液在4个辐照开/关周期下温度变化图

图3 AIPH@PB NPs的紫外可见吸收光谱图

2.4 AIPH@PB NPs的生物相容性和近红外杀伤性能

如图4A所示，在不同浓度的AIPH@PB NPs作用下MEF和4T1细胞均显示出低毒性。即使在高浓度800 μg/mL下两种细胞活力均高于80%。由此表明，AIPH@PB NPs在一定浓度范围内具有很好的生物相容性。

如图4B、4C所示，在相同近红外光(1.5 W/cm2，5 min)照射下，与未添加AIPH@PB NPs的对照组相比，两种细胞活力随着AIPH@PB NPs浓度增加均逐渐递减，其中4T1 细胞活力下降趋势更加明显，在800 μg/mL AIPH@PB NPs处理下，MEF细胞活力仍高于80%，而4T1细胞活力仅为15%。可能是由于肿瘤细胞对温度变化更加敏感，所以其光热杀伤效果和烷基自由基生成能力更加显著。由此说明，制备的AIPH@PB NPs介导的光热消融和烷基自由基生成可协同作用，达到有效杀伤肿瘤的效果。

A：MEF细胞和4T1细胞与不同浓度AIPH@PB NPs共培养后的细胞活力；B、C：经过808 nm近红外光(1.5 W/cm2，5 min)照射后MEF细胞和4T1细胞活力。*：P<0.05，与0 μg/mL AIPH@PB NPs比较

3 讨论

本文利用血清白蛋白、AIPH和多巴胺为底物，通过一步氧化法成功制备AIPH@PB NPs。其形态均一、粒径适宜、生物相容性好，具有非晶体结构。同时，AIPH@PB NPs具备较高的光热转换效率和优越的光热稳定性；可在808 nm近红外激光照射下迅速升温，并且随着照射次数的增加光热效果保持稳定。

更加重要的是由于正常细胞具有较好的热耐受性，一定浓度范围内的AIPH@PB NPs在近红外激光照射下产生的热量对正常细胞影响很小而可以直接杀伤乳腺癌细胞。由此可显著降低光热消融对正常组织的损伤，提高对乳腺癌细胞的特异性杀伤能力。此外，近红外光激发产生的过高热不仅可以直接杀伤乳腺癌细胞，还能促使AIPH裂解并释放烷基自由基，进一步引起多种细胞成分的破坏，最终导致细胞凋亡。由此可见，AIPH@PB NPs介导的光热消融和烷基自由基生成可协同作用，达到有效杀伤乳腺癌细胞的目的。

综上所述，本研究制备的AIPH@PB NPs可以将化学动力疗法与光热疗法结合在一起，具有优越的光热转换效能和高效的烷基自由基产生能力，在乳腺癌的治疗领域具有一定的应用前景。