南宁地区献血人群ABO亚型的分子遗传学研究

2021-09-18何保仁刘金莲刘学军

中国医药科学 2021年24期

何保仁刘金莲刘学军

[摘要]目的调查研究南宁地区无偿献血人群 ABO 亚型的分布特点及分子遗传学特征。方法收集2017年3月至2018年12月南宁地区无偿献血者血液样本，采用试管法对微板法筛查出的正反定型不一致的样本进一步做血型血清学分析，并进行亚型确认。对亚型样本进行基因克隆测序，测序结果用软件比对分析后，确定其基因型。结果从2017年3月至2018年12月南宁地区无偿献血者225587例血液样本中检出 ABO 亚型41例，其中 A 亚型6例、B 亚型25例、AB 亚型10例。对41例 ABO 亚型样本进行克隆测序分析，共检测出3个常见 O 等位基因（O01、O04、O13）;3个常见 A 等位基因（A101、A102、Ael08）以及一个新的 A 等位基因;4个常见 B 等位基因（B101、B108、B305、Bw11）以及一个新的 B 等位基因。结论 ABO 亚型分布存在不均衡性和地域性差异。南宁地区献血人群 B 亚型出现的頻率高于 A 亚型，最常见的亚型是 A102和 Bw11。

[关键词]献血人群; ABO 血型; ABO 亚型;克隆测序

[中图分类号] R394.3 [文献标识码] A [文章编号]2095-0616（2021）24-0030-04

Molecular genetics research on the ABO subtypes of the blood donors in Nanning region

HE Baoren LIU Jinlian LIU Xuejun

Nanning Institute ofTransfusion Medicine， Guangxi， Nanning 530007， China

[Abstract] Objective To probe into the distribution characteristics and molecular genetic characteristics of ABO subtypes among the voluntary blood donors in Nanning region . Methods The blood samples of the voluntary blood donors in Nanning from March 2017 to December 2018 were collected . For the samples screened by microplate technique to be with inconsistent positive and negative typing， further blood group serological analysis was carried out， and the subtypes were confirmed . After clone sequencing of genes of the subtype samples， the sequencing results were compared and analyzed by software and the genotypes were determined . Results From the 225587 blood samples of the voluntary blood donors in Nanning region from March 2017 to December 2018， 41 ABO subtypes were detected， of which 6 were subtype A， 25 were subtype B， and 10 were AB subtype . According to the clone sequencing analysis of 41 ABO subtype samples， those alleles that were detected included 3 common O alleles （O01， O04， O13）， 3 common A alleles （A101， A102， Ael08） and 1 new A allele， 4 common B alleles （B101， B108， B305， Bw11） and 1 new B allele . Conclusion The distribution of ABO subtypes is unbalanced， and it varies among regions . The frequency of subtype B among the blood donors in Nanning region is higher than that of subtype A， and the most frequently seen subtypes are A102 and Bw11.

[Key words] Blood donors; ABO blood group; ABO subtype; Clone sequencing

自1900年奥地利科学家 Karl Landsteiner 发现 ABO 血型以来，ABO 血型系统一直是临床输血中最重要的血型系统之一[1-3]。在临床输血中，供受者 ABO 血型不合可导致严重的溶血反应，主要原因是 ABO 亚型引起的血型误判或漏检。因此，精准鉴定献血者的血型对保障临床输血安全具有重要意义。 ABO 亚型是由于基因突变，导致红细胞表面 A 抗原或 B 抗原表达数目减少，因此与抗 A 或抗 B 血清反应出现凝集强度减弱的现象[4-5]。本研究对2017年3月至2018年12月南宁输血医学研究所献血者常规血型检测中发现的41例 ABO 亚型标本进行基因克隆测序分析，旨在了解南宁地区献血人群 ABO 血型分布情况及 ABO 亚型分子生物学特征，积累本地区人群血型大数据资料，同时规范献血者血型筛查，以保障临床用血的安全性、有效性。现报道如下。

1资料与方法

1.1一般资料

收集2017年3月至2018年12月南宁市无偿献血者血液标本，进行常规血型检测，对正反定型不一致的标本进行进一步分析，经吸收放散实验确定为 ABO 亚型的标本共41例，其中男23例、女18例，年龄18～55岁，均为身体健康的无偿献血者。

1.2试剂与仪器

单克隆抗-A、抗-B 和抗-H（上海血液生物公司）、抗-A1抗体（荷兰Sanquin公司）;人 ABO 反定型用红细胞试剂（北京金豪公司）;抗-AB 抗体（DIAGAST 公司）;pGEM_T Vector 系统（美国 Promega 公司）;KA-2200型离心机（日本久保田公司）;GentraPuregene Blood Kit 外周血基因组抽提试剂盒（德国 QIAGEN 公司）;9700型基因扩增仪和 ABI3730型 DNA 测序仪（美国应用生物系统公司）。所有试剂均在有效期内使用。

1.3方法

1.3.1血型血清学实验对微板法筛查中发现正反定型不一致或者抗原凝集强度较弱的样本，采用试管法进行 ABO 亚型鉴定，包括 ABO 正反定型试验、冷吸收热放散试验，按血清学诊断标准来判断结果并进行 ABO 亚型鉴定和分类[6]。

1.3.2基因克隆测序采用GentraPuregene Blood Kit 提取 ABO 亚型标本基因组 DNA 备用，操作按试剂说明书进行。通过 Primer 5.0软件在 ABO 基因的第5内含子侧翼和第7外显子之间设计引物（引物序列： ABO-F AGA GGA GGC AGA AGC TGA GTG GAG TTT C，ABO-R AGT TTA CCC GTT CTG CTA AAA CCA AGG G），用于扩增目的片段（引物由上海生工合成）。PCR 扩增体系：95℃預变性5 min，95℃变性30 s，65℃退火30 s，72℃延伸150 s，35次循环，完成后于72℃延伸5 min。扩增片段长度为2.1 kb，扩增产物胶回收纯化。通过 T4 DNA 连接酶将目的片段连接到pGEM_T质粒上，转化到 DH5α感受态细胞里，涂平板培养，挑取10个阳性克隆进行测序。

1.3.3序列分析使用 Chromas 软件阅读测序图谱，通过AlignX软件与 GenBank 中的序列（NM_020469）进行比对，确定基因型。

2结果

2.1 ABO亚型血清学检测结果

2017年3月至2018年12月南宁地区献血人数225587人，检出 ABO 亚型41例，其中 A 型献血人数52642人，亚型6例;B 型献血人数59441人，亚型25例; AB 型献血人数12216人，亚型10例; O 型献血人数101288人，未检出亚型标本。

2.2 ABO基因克隆测序结果

本研究对41例 ABO 亚型样本的第6、7外显子和第6内含子以及两侧侧翼进行克隆测序分析，共检测出3个常见 A 等位基因（A101、A102、 Ael08）以及一个新的 A 等位基因，命名为Anovel;4个常见 B 等位基因（B101、B305、B108、Bw11）以及一个新的 B 等位基因，命名为Bnovel;3个常见 O 等位基因（O01、O04、O13），见表1。本研究发现3例标本检出两种新的等位基因突变，一种血清学定型为 A 亚型，克隆测序显示，一条链为 O01，另一条链与 A101比对，存在467C > T，737A > G 突变，导致氨基酸 P156L、Y246C 替换;另一种血清学定型为 B 亚型，克隆测序显示，一条链为 O13，另一条链与 B101比对，存在734C > T 突变，氨基酸 T245I 替换，两种新发现的等位基因序列均已提交到 GenBank，序列号为： MK144787和 MK568546。

3讨论

ABO 血型抗原较其他血型系统抗原更为复杂， ABO 基因的编码产物为特异性糖基转移酶，由糖基转移酶引导合成 ABO 抗原[7]。ABO 血型是临床输血必须鉴定的血型之一，除了常见的4种 ABO 表型之外，根据红细胞与抗血清或血凝集素的凝集反应强度、血清中抗体以及唾液等分泌液中血型物质， ABO 表型又有 A 亚型和 B 亚型之分。目前血型抗原基因突变数据库上已报道的 ABO 等位基因有397个，其中 A 等位基因152个、B 等位基因108个，由血清学定义的同一种 ABO 亚型可以对应多种等位基因[8]。

南宁地区献血人群 ABO 血型分布为 O 型最多，占44.9%，其次是 B 型，占26.35%， A 型占23.34%， AB 型占5.41%，分布数量为 O > B > A > AB，与海南、广州等地分布比较接近[9-11]，符合中国南方各省 O 基因频率较其他地区高的特点。本研究显示 B 亚型的出现频率明显高于 A 亚型的出现频率，与张嵘等[7，12-13]报道一致。A 亚型等位基因主要为 A102，未检测到 A2等位基因。 A102在中国人群的比例相对较高，是常见基因型。A102与 A101在序列比对上，发生467位点的单个碱基替换（C → T），导致氨基酸 Pro → Leu 替换，两者翻译糖基转移酶的活力无明显差异[14]。但是在本研究血清学实验中发现的 A102凝集强度均较弱，因本研究只做第6、7外显子和第6内含子测序，推测是其他外显子或者调控区存在变异导致[8]。B 亚型等位基金主要是 Bw11，说明 Bw11亚型在本地区比较常见，Bw11亚型是由喻琼等[15]首先报道的，与 B101等位基因的差异仅在于 nt695位点 T > C 突变，相应的232位氨基酸由亮氨酸转变为脯氨酸，导致糖基转移酶活性部分丧失。O 亚型等位基因主要为 O01和 O13，其中 O01是中国人群中比较常见的等位基因，O13在其他地区比较少见，推测是广西地区人群特有的基因特征。

本研究发现两个新的等位基因，新的等位基因都是错义突变，推测可能是由于氨基酸的替换改变了糖基转移酶构象，使酶活性降低。关于其如何影响酶的活性，还需进一步研究。

ABO 亚型虽然较为少见，但其可能严重影响输血的安全性和有效性。研究并阐明南宁地区人群 ABO 亚型的分子遗传学特点，不仅可以指导临床安全输血，降低输血风险，还能对我国人类遗传学研究、血型与疾病相关性研究及法医物证鉴定等提供帮助。

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