系统生物学技术用于中药肝毒性机制的研究进展

高乔 张润涛 刘聪 倪艳 康永

[摘要]介绍研究中药肝毒性的重要性及其现状，中药毒性古今不同定义和现代研究对其毒性成分和作用机制的研究情况，以及系统生物学技术在中药毒性研究中的优势，系统生物学各方面的技术应用在中药毒理学当中的研究进展，包括通过对不同基因比较的基因组学分析、通过进行比较差异蛋白表达的蛋白组学分析、通过差异代谢物的代谢组学比对分析以及通过基因转录和基因表达差异的转录组学分析等现代技术手段进行的更加广泛和深入的中药肝毒性机制研究，此类新型的中药肝毒性研究思路和方法既与中医的整体观念更加接近，而且也使得中药毒性研究手段上升到更加先进的水平，开辟中药毒性研究的新领域，同时还有望使人们对中药肝毒性的认识取得更多突破性进展。

[关键词]系统生物学技术;基因组学技术;蛋白组学技术;代谢组学技术;转录组学技术;中药肝毒性

[中图分类号] R285  [文献标识码] A   [文章编号]2095-0616（2021）24-0053-05

Research progress of systems biotechnology in hepatotoxicity mechanism of traditional Chinese medicine

GAO  Qiao    ZHANG  Runtao    LIU  Cong    NI  Yan    KANG  Yong

Shanxi Academy of Chinese Medicine， Shanxi， Taiyuan 030012， China

[Abstract] This paper introduces the importance and status quo of researches on hepatotoxicity of traditional Chinese medicine （TCM）， the different definitions of toxicity of TCM in ancient and modern times， the research situation of its toxic components and action mechanism， the advantages of systems biotechnology in toxicity research of TCM， and the research progress of the application of systems biotechnology in toxicology of TCM， which includes a more extensive and in-depth study on hepatotoxicity mechanism of TCM by modern technical means such as comparative genomics analysis of different genes， proteomics analysis of comparative differential protein expression， comparative metabonomics analysis of differential metabolites， and transcriptomics analysis of gene transcription and differential gene expression. This new thinking and method of research on hepatotoxicity of TCM is not only closer to the concept of holism of TCM， but also makes the research methods of toxicity of TCM rise to a more advanced level， breaking new ground of research on toxicity of TCM， and at the same time， it is expected to make more breakthrough progress in people's understanding of hepatotoxicity of TCM.

[Key words] Systems biotechnology; Genomics technology; Proteomics technology; Metabonomics technology; Transcriptomics technology; Hepatotoxicity of traditional Chinese medicine

近年来，中药在应用于各类型疾病治疗中获得良好效果，但是中药治疗造成的毒性以及不良反应时有发生，因此中药毒性事件引起人们广泛关注。中药毒性研究运用系统生物学新技术探索毒性反应机制，同时结合传统毒理学的实验方法，能够更快地找到中药毒性靶器官并对其造成毒性损伤机制取得进一步认识[1]。药物不论通过哪种途径被吸收，进入人体循环以后，均被肝脏代谢或摄取。所以，肝脏是药源性损伤的重要靶器官。药物性肝损伤就是由所服用药物或其代谢产物引起的肝脏损伤[2-3]，临床中主要表现有肝细胞型损伤、混合型肝损伤、胆汁淤积型肝损伤、非酒精性脂肪肝型损伤等[4-6]。根据世界卫生组织（WHO）相关数据统计证实，药物性肝损伤所导致的死亡率成为全世界疾病死亡率的第五位[7]。其次，有文献记载，引起肝损伤的前三位药物分别是中草药、抗结核药及抗生素[8]。就其危害而言，轻则损害肝功能，重则导致肝衰竭、肝器质性病变，甚至死亡。以往的毒理学研究大部分采取动物模型作为基础，以血液及生化指标和组织病理结果作为毒性检测重点，但是缺乏特异性和灵敏性，系统生物学技术能够很好地弥补传统毒理学整体性不足的缺陷。主要包括基因组学技术、蛋白组学技术、代谢组学技术和转录组学技术[9-10]，研究的是一个生物系统当中所有组成成分的沟通以及在特定情况下的相互关系，包括通过对不同基因比较的基因组学分析、通过进行比较差异蛋白表达的蛋白组学分析、通过差异代谢物的代谢组学比对分析以及通过基因转录和基因表达差异的转录组学分析等现代技术手段进行的更加广泛和深入的研究，此类新型的中药研究思路和方法既与中医的整体观念更加接近，而且也使得中药研究手段上升到了更加先进的水平，因此该技术被广泛運用到了研究毒理学及各领域学科中。

1中药毒性的定义

有毒中药概念的形成有一定的历史背景。在我国，中药一开始就被称作“毒药”。《周礼·天官》记载：“医师掌医之政，聚毒药以供医事”。《类经·卷十四》指出：“凡可避邪安正者，皆可称之为毒药”。其次，“毒药”指的是药物的偏性，因为在中医阴阳五行理论的指导下，医家运用中药的特性即“偏性”来调节脏腑功能，平衡阴阳盛衰，驱除病邪，所以广义的“毒”指的是药物的偏性，中药治病是以药物偏性纠正人体偏性[11]，而狭义之“毒”指的是有毒性的中药在治疗过程中对人体造成的伤害作用[12]。《中华人民共和国药典》2020年版共收载有毒中药 83种，其中大毒中药10种，有毒中药42种，小毒中药31种[13]。

2肝毒性的中药成分和作用机制的研究情况

研究表明，引起肝损伤的成分主要包括含有皂苷成分的三七、商陆、黄药子[14-15]等，含有生物碱类成分的千里光[16-17]、菊三七等，含有萜类成分的雷公藤[18]、川楝子[19]等，含有毒蛋白成分的苍耳子[20]、蜈蚣[21]等。

通过系统生物学技术和传统毒理学研究，发现导致中药肝毒性的作用机制可能与药物代谢酶基因表达异常[22-23]、肝细胞凋亡失调[24-25]、脂质过氧化损伤[26-27]、线粒体损伤[28-29]、炎症反应等有关[30-31]。

3系统生物学在中药肝毒性研究中的应用

3.1基因组学在中药肝毒性研究中的应用

基因组学是对生物体所有基因进行集体表征、定量研究及不同基因组比较研究的一门交叉生物学学科。基因组学主要研究基因组的结构、功能、进化、定位和编辑等，以及它们对生物体的影响[32]。

胡燕珍等[33]对栀子的主要成分京尼平苷导致肝毒性的相关基因通过基因组学进行筛选和分析，共检测出324个与肝毒性相关的差异表达基因，其中上调259个，下调65个。经筛选后的9种基因通过聚合酶链式反应（PCR）验证后，发现其中的药物代谢酶（Cyp2c23）、核受体亚家族（Nr0b2）、Ⅰ型胶原蛋白（Colα1）、醛缩酶（Aldob）、B 淋巴细胞瘤-2（Bcl2）等5种基因得到了验证，其中 Cyp2c23、Nr0b2、Aldob这3种下调基因表达有显著差异。并进一步通过基因功能分析（GO analysis）和通路分析（pathway analysis）发现，京尼平苷作用于机体后主要涉及细胞凋亡、信号转导、细胞周期、物质代谢、转录调控等生物过程。而从经验证的靶基因来推断，京尼平苷所导致的肝毒性机制可能与机体发生氧化应激和线粒体损伤、1-磷酸果糖细胞毒性和腺苷三磷酸（ATP）缺失有关，还可能与Ⅰ型胶原蛋白（Collagenα1）基因表达异常有关。纪彩[34]研究发现川楝子具有明显的肝毒性，其中在小鼠实验中，通过对给药后的小鼠肝组织进行基因组学分析发现，小鼠的肝脏信使核糖核酸（mRNA）和 MicroRNA（miRNA）表达谱变化具有明显时间依赖性;并发现导致肝脏损伤的主要机制是川楝素引起的肝细胞坏死和脂质代谢紊乱，肝细胞线粒体紊乱可能也是损伤原因之一;同时，胆固醇的生物合成和肿瘤抑制蛋白（p53）信号通路等可能参与肝损伤后的再生修复过程。随着不断地深入研究，新的成果也将会不断出现，基因组学研究未来具有非常广阔的应用前景。

3.2蛋白质组学在中药肝毒性研究中的应用

蛋白质组学本质上指的是在大规模水平上研究蛋白质的特征，包括蛋白质的表达水平、翻译后的修饰、蛋白与蛋白的相互作用等，由此获得蛋白质水平上关于疾病发生，细胞代谢等过程的整体而全面的认识。通过对正常个体和病理个体间的蛋白质组比较分析可以找到差异性和特异性的蛋白质分子，从而可能找到通过药物作用细胞、组织或基因组所表达的蛋白质功能的区别之处。

程源等[35]对诃子的上清液采用蛋白质组学方法研究其毒性机制，结果表明诃子上清液对小鼠肝脏中蛋白质表达具有显著性影响。从中分析出差异性蛋白20个，分别是 ATP 合成酶α亚基、乳酸谷胱肽链合酶（乙二醛酶）、硫代硫酸转移酶、甜菜碱高半胱氨酸甲基转移酶1、细胞色素 b5、氨甲酰磷酸合成酶、盐酸磷酸核糖转移酶等。这些差异性蛋白与机体的氨基酸代谢、能量代谢、氧化应激反应等机制过程相关。另外，林龙飞[36]用同位素标记相对和绝对定量（isobaric tags for relative and absolute quantification，iTRAQ）蛋白质组学技术对何首乌不同部位所致肝损伤大鼠与正常大鼠肝脏表达谱进行比较，结果共筛选出31个共表达蛋白，分析得出何首乌导致肝损伤主要与三羧酸循环（TCA）信号通路传导异常和线粒体氧化磷酸化的功能相关。其主要原因可能由于还原型辅酶Ⅰ（NADH）脱氢酶的表达异常、苯丙氨酸的代谢异常，这些异常反应会引起氧化磷酸化功能障碍，从而导致线粒体功能受损、呼吸链中的电子泄漏增多，进一步使活性氧（ROS）产生增加;此外，转运蛋白低表达引起胞内磷脂酰肌醇激酶（PI3K）/蛋白激酶 B（Akt）信号通路和 Akt 不能被激活，从而导致 p53蛋白及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（Caspase-9）的表达不能被抑制而使细胞凋亡。由于特定蛋白质与毒性损伤机制有密切关联，或许可以建立一个完善的毒理蛋白质组数据库，能够在不同程度上予以鉴定、预测以及区分药物的肝脏毒性。从上述研究发现，蛋白质组学对中药肝毒性机制研究有一定的价值，未来对肝脏疾病的基础研究也可做出其应有的贡献。

3.3代谢组学在中药肝毒性研究中的应用

代谢组学是继基因组学和蛋白质组学之后新近发展起来的一门学科，是系统生物学的重要组成部分，近年来得到迅速发展并渗透到多项领域。基因组学和蛋白质组学分别从基因和蛋白质层面探寻生命的活动，而这些层面的活动都是受代谢物调控的。因此，代谢组学正是研究代谢组（metabolome）在细胞信号释放（cell signaling），能量传递，细胞间通信等所有代谢功能的一门学科。代谢物反映了细胞所处的环境，这与细胞的营养状态，药物和环境污染物的程度，以及其他外界因素的影响密切相关。它通过代谢物指纹分析（metabolomic fingerprinting）和液相色谱-质谱联用（LC-MS）的方法，比较不同血样、组织、排泄物等各自的代谢产物，分析其中的所有代谢物，以此来假定一条特定的代谢通路，并對此进行更深入的研究。

根据有关研究表明[37]，二氢杨梅素能够保护肝细胞免受大黄素引起的肝毒性。二氢杨梅素是粗柄蛇葡萄中发现的重要黄烷酮，对肝脏损伤具有保护作用。Jing 等[37]采用大鼠血清、尿液和肝脏样品，进行系统生化分析、病理观察和非靶向代谢组学。推测它可能是通过改善肝脏代谢来缓解肝损伤。结果分析出在大鼠尿液和血清中15种代谢产物中有8种受二氢杨梅素的显著调控;代谢通路分析显示，谷胱甘肽代谢、嘧啶代谢和色氨酸代谢是影响肝脏代谢的通路;其中，经分析出的18种蛋白被预测是大黄素减轻肝损伤过程中二氢杨梅素的潜在靶点。林龙飞[36]在研究何首乌导致的肝损伤过程当中，经代谢组学研究发现，甘油磷酸代谢通路异常会产生溶血磷脂酰胆碱在血液中浓度升高，这种状态可以导致红细胞膜的溶解，从而导致溶血性疾病的发生;研究显示，在脂质代谢中通过调控靶基因的表达可以调节机体许多生理功能包括脂肪酸摄取、氧化及脂质运输、结合、生長发育等。何首乌导致的肝损伤机制还与花生四烯酸代谢通路、胆汁酸、类固醇类化合物以及与激素的生物合成和代谢相关的类固醇合成有关。目前，代谢组学技术虽然与中医的整体思维相类似，然而因为当今研究技术存在的缺陷和数据分析存在的不足，还没有办法全部替代药理、分子以及生化等相关常规技术，因此，需要与以往研究方法有效结合起来，高度重视中医基础知识，增强与中医治疗技术之间的合作，才能使代谢组学技术在中医药治疗的临床与科研中发挥更好的作用。

3.4转录组学在中药肝毒性研究中的应用

转录组学是研究特定的细胞、组织或个体在特定时间和状态下所转录出的核糖核酸（RNA）的学科，转录组测序是指利用高通量测序方法研究这些 RNA，用于揭示不同功能状态下的基因表达、结构的差异，阐明分子机制。转录组学是研究细胞表型和功能的一个重要手段。基因组学在主要毒性研究当中可以更容易揭示基因表达与蛋白质功能之间的关系，为找到适合的作用通路做出判断依据，同时为药物的肝毒性损伤机制提供更好的依据。

赵杰[38]通过对不同剂量雷公藤甲素作用下的基因表达谱进行了检测，经过分析发现多个基因的表达显著改变，差异表达基因呈现明显的剂量依赖性。差异表达基因富集的通路主要包括芳香族化合物受体（AHR）信号、转录因子 NF-E2相关因子（Nrf2）介导的氧化应激反应、凋亡信号巨噬细胞中一氧化氮（NO）及 ROS 生成及脂多糖（LPS）介导的维甲酸受体（RXR）功能抑制、肝纤维化、白细胞介素-8（IL-8）信号、核因子κB（NF-κB）信号、过氧化物酶体增殖物激活受体（peroxisome  proliferators-activated receptors， PPARs）信号、肝星状细胞激活和肝脏胆汁淤积等通路。此结果表明雷公藤甲素肝损伤的机制与肝细胞死亡、炎症反应和代谢紊乱等有关。曹洒[39]通过构建化合物-靶点以及转录组学方法来研究细辛散剂的肝脏毒性机制，根据测序分析发现有显著变化的基因共434个，其中显著上调的有214个，下调的有220个。这些差异基因富集后主要与昼夜节律、代谢途径、 p53信号转导途径、类固醇生物合成、胆汁分泌等通路有关。

4总结

肝损伤是一个非常复杂的病理过程，其可能通过药物或代谢产物造成损伤，同时还可能因为药物作用期间部分炎症反应通路被充分激活而导致损伤，此外还与个体给药当中的敏感性有密切关系。与传统的中药毒理学研究方法相比，系统生物学具有非常大的优势，拥有广阔前景，能够更加迅速和准确地发现毒性物质与作用靶点。与此同时，系统生物学技术的整体观念越强，越能够充分体现中医药多成分、多层面以及多靶点的特征，此类新型的中药肝毒性研究思路和方法既与中医的整体观念接近，而且也使得中药毒性研究手段上升到更加先进的水平，开辟中药毒性研究的新领域，同时还有望能使人们对中药肝毒性的认识取得更多突破性进展。

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（收稿日期：2021-08-20）