基于分子对接和网络药理学的僵蚕息风止痉作用机制分析

王巧宇，刘莹，申金田，王开元，梅荣，汤建，张林松，闻崇炜

(1. 江苏大学药学院，江苏 镇江 212013； 2. 镇江市食品药品监督检验中心，江苏 镇江 212050； 3. 亳州学院中药学院，安徽 亳州 236800)

僵蚕为蚕蛾科昆虫家蚕BombyxmoriLinnaeus的幼虫感染白僵菌Beauveriabassiana(Bals.) Vuillant而致死的干燥体，圆柱形，多弯曲皱缩；气微腥，味微咸，性平，归肝、肺、胃经，具有息风止痉、祛风止痛、化痰散结之功效[1]。研究发现僵蚕多种化学成分(包括蛋白质、多肽、氨基酸、甾体、黄酮、有机酸等)具有抗惊厥、抗凝、抗菌、抗癌、降糖、降脂、神经营养和保护等作用[2]。研究表明[3-4]，僵蚕粉末抗惊厥效果优于僵蚕煎液，能够显著降低小鼠惊厥率，僵蚕提取物对最大电休克惊厥模型有对抗作用。

网络药理学是基于系统生物学理论而发展出的新的研究手段，它通过高通量组学数据分析、软件处理，构建“药物-活性成分-靶点”的网络，将药物与机体的作用整体系统地表现出来。中药具有多组分、多靶点、多途径的特点，通过网络药理学研究可以提供可量化数据，科学解读中药治疗疾病的作用机制[5-6]。目前，僵蚕的息风止痉作用机制尚不明确。本文采用网络药理学方法，探索僵蚕主要物质基础与靶点、疾病的相互作用关系，以系统、全面地阐述僵蚕息风止痉的药理作用机制。

1 材料与方法

1.1 数据库与软件

PubChem数据库 (http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)、DisGeNET数据库(http://www.disgenet.org/)、David生物信息注释系统 (https://david.ncifcrf.gov/)、KEGG数据库(http://www.genome.jp/kegg/)、STRING数据库(https://string-db.org/)、Swiss Target Prediction、ChemDraw14.0、Cystoscape 3.5.1、Open Babel 2.4.1。

1.2 僵蚕化学成分的收集与整理

通过文献检索僵蚕的化学成分，剔除氨基酸及核苷等成分，利用 PubChem 数据库获取相关成分的3D化学结构，并采用ChemDraw 软件绘制PubChem 数据库中未收载的成分，所有化学结构文件均采用 Open Babel 2. 4. 1 软件转换为Smiles格式保存。

1.3 僵蚕化学成分潜在靶点的预测与筛选

将僵蚕化学成分的Smiles格式上传至Swiss Target Prediction分析软件，设置属性为“Homo sapiens”进行靶点的预测与筛选，并提取靶蛋白、靶基因名称。

1.4 僵蚕抗惊厥潜在作用靶点及注释

将惊厥(convulsions)作为关键词输入DisGeNET数据库，检索相关的人类基因，再将获得的靶点信息与僵蚕活性成分潜在靶点相比对，最后得到僵蚕息风止痉作用的靶点及蛋白信息。

1.5 僵蚕抗惊厥“活性成分-靶点”网络的构建

使用Cytoscape软件构建“药物-活性成分-靶点”网络模式，绘制僵蚕成分与其治疗惊厥靶点的作用网络图。

1.6 僵蚕抗惊厥靶点PPI网络的构建与分析

使用STRING数据库构建僵蚕靶蛋白之间的相互作用网络(PPI)，将蛋白种类设置为“Homo sapiens”、最低相互作用阈值设为“medium confidence”，其余参数均保持默认操作。用Cytoscape软件中的“Network Analyzer”插件，分析PPI网络的拓扑属性，计算“节点度值分布”和“介数中心性”网络拓扑参数，进而获得僵蚕治疗惊厥的关键靶点。

1.7 基因功能分析与通路富集分析

利用Cytoscape软件中的“BiNGO”插件从生物过程、分子功能以及细胞组成3个方面对僵蚕治疗惊厥的潜在作用靶点进行 GO 富集分析。另外，利用David平台对僵蚕治疗惊厥的潜在作用靶点进行KEGG通路富集分析。

1.8 分子对接模拟

将筛选出的主要活性成分通过PubChem下载其SDF格式，将筛选的主要蛋白靶点通过 PDB 数据库选择其最佳蛋白晶体结构，并下载其PDB格式文件。将下载好的蛋白质及活性成分导入PyMol进行拆分、格式转化等预处理。蛋白靶点及化学成分导入 AutoDock软件，进行除水、加氢，计算电荷，运行软件对活性成分和靶点蛋白分别进行对接。在输出结果中，结合能越低，表明活性成分与靶蛋白之间的结合力越强。

2 结果

2.1 僵蚕的化学成分

文献检索获得僵蚕18个化学活性成分，其中多肽类2个、甾体类9个、黄酮类5个、有机酸类2个。

2.2 僵蚕化学成分抗惊厥潜在靶点的预测与筛选

基于Swiss Target Prediction平台预测上述化学成分的潜在作用靶点，除quercetin-4′-O-methyl-7-O-b-D-glucopyranoside未找到作用靶点外，其他17个成分共获得作用靶点1 311个，删除重复项后获取有效作用靶点513个。以Convulsions为关键词，基于DisGeNET数据库，检索得到相关基因117个，将僵蚕活性成分靶点与惊厥致病基因进行比对，得到僵蚕抗惊厥作用靶点共22个，提取靶点相关信息。包括丁酰胆碱酯酶(Butyrylcholinesterase)、多巴胺D4受体(Dopamine D4 receptor)以及环氧合酶2(Cyclooxygenase-2)等22个靶点均与僵蚕抗惊厥有直接或间接作用。

2.3 僵蚕活性成分-靶点网络的构建

以Cytoscape软件对僵蚕活性成分与作用靶点的对应关系进行图形化展示并构建活性成分-靶点网络。18个活性成分中有16个与僵蚕抗惊厥靶点有直接作用(图1)。由网络拓扑学结构数据可知化合物的中位度数为5，筛选出度值≥5的化合物有3β,5α-二羟基-(22E,24R)-麦角甾醇-7,22-dien-6-酮；(22E,24S)-5,8-环氧-24-甲基胆甾醇-6,9(11),22-三烯-3-醇；22E-7α-甲氧基-5α,6α-环氧麦角甾醇8(14),22-dien-3β-醇；环(L-脯-L-缬)；山奈酚；环(丙脯)二肽；槲皮素；豆甾烷-7,22-二烯-3β,5α,6α-三醇；5,6-环氧-(22E,24R)-麦角甾醇-8(14)22-二烯-3,7-二醇；度值分别为10、9、7、6、6、5、5、5、5，这9个化合物可能是僵蚕息风止痉的主要物质基础。

图1 僵蚕“药物-活性成分-靶点”网络关系图

2.4 僵蚕抗惊厥靶点PPI网络的构建与分析

PPI网络分析发现有20个节点、58条相互作用连线(图2)，线条的粗细代表了相互作用力的强弱，度值平均为5.8，介数平均为5.029 2×10-2。靶点度值和介数均超过平均值的靶点共有6个(表1)，包括Interleukin-6、Mu opioid receptor等。

表1 关键靶点的拓扑参数

图2 僵蚕抗惊厥作用靶点的PPI网络图

2.5 基因功能分析与通路富集分析

GO富集分析结果如图3所示，22个靶点主要在细胞膜上通过调节细胞过程、细胞转运活性和受体活性，对刺激应答等生物过程发挥作用。

图3 僵蚕抗惊厥靶点GO富集分析

KEGG通路富集共筛选出有关神经递质、内分泌、信号转导、物质代谢等9条信号通路(图4)。

图4 僵蚕主要靶点 KEGG 富集通路气泡图

2.6 分子对接模拟

分子对接结果经过热图分析得到图5(对接结果只保留每对分子对接的结合能绝对值最高的)，对接打分的绝对值≥7的活性成分有5个(9.26%)，绝对值在7到3.5之间的有47个(87.03%)，绝对值<3.5的有2个(3.70%)。僵蚕中活性成分与惊厥潜在靶点分子的结合图见图6。

compound 1: 3β,5α-二羟基-(22E,24R)-麦角甾醇-7,22-dien-6-酮；compound 2: (22E,24S)-5,8-环氧-24-甲基胆甾醇-6,9(11),22-三烯-3-醇；compound 3: 22E-7α-甲氧基-5α,6α-环氧麦角甾醇8(14),22-dien-3β-醇；compound 4: 环(L-脯-L-缬)；compound 5: 山奈酚；compound 6: 环(丙脯)二肽；compound 7: 槲皮素；compound 8: 豆甾烷-7,22-二烯-3β,5α,6α-三醇；compound 9: 5,6-环氧-(22E,24R)-麦角甾醇-8(14)22-二烯-3,7-二醇。无原配体的蛋白靶点以-4 kcal/mol为打分值，用“×”标注

3 讨论

惊厥是儿科常见急症，也是最常见的小儿神经系统症状，以临床出现肢体节律性抽搐、昏迷为主要特征。引起惊厥发作的病因有很多，主要以热性惊厥、颅内感染和癫痫为主[7]。惊厥的频繁发作或持续状态可危及患儿生命或使患儿脑部损伤，影响小儿的智力发育和健康。研究表明[8]，脑细胞生理代谢发生变化可使钙离子泵功能失调，钠、钙离子增多，使脑细胞肿胀、结构损害甚至死亡。临床上抗惊厥的药物有很多，通过网络药理学可以分析其可能的作用机制。

在PPI网络图中得到靶点度值和介数均超过平均值的靶点有IL-6、PTGS2、CNR1、DRD2、ACHE和OPRM1。IL-6基因在胚胎发育过程中，作为信号分子从肝窦内皮细胞中分泌，影响肝小叶的生长与功能。ACHE在类红细胞和神经元突触中表达。在脊椎动物中，乙酰胆碱是神经元之间信息传递的关键物质[9]，可将信号从神经系统传递到肌肉纤维的兴奋性神经递质，刺激肌肉使肌肉僵直。已有研究表明，乙酰胆碱受体与多种神经系统疾病密切相关，如癫痫、精神分裂症、老年痴呆症等[10]，提示IL-6与ACHE在治疗神经系统疾病方面发挥重要作用，这也说明僵蚕治疗癫痫、惊厥等病症具有一定的功效。

A：PTGS2和compound 3；B：OPRM1和compound 6；C：IL-6和compound 6；D：DRD2和compound 6；E：CNR1和compound 2；F：ACHE和compound 3

GO富集与KEGG通路富集分析结果显示，僵蚕抗惊厥作用靶点主要分布在细胞膜上，具有受体活性、细胞转运活性、蛋白质结合及对刺激应答等功能，并通过神经递质、内分泌、信号转导、物质代谢等9条信号通路发挥作用，预测的靶点和通路大多与神经保护密切相关，靶点与通路协调发挥抗惊厥作用，提示这可能是治疗惊厥的关键。惊厥的发病部位主要是神经系统，神经活性配体-受体相互作用通路与高热惊厥和夜间额叶癫病相关，抗内源性大麻素信号通路与婴儿早期癫痫性脑病相关，胆碱能突触通路与良性家族性新生儿惊厥和夜间额叶癫痫疾病相关，可以推测这些是僵蚕抗惊厥作用的关键通路[9-10]。已有文献报道[11]，尼古丁成瘾性通路可参与神经转导、免疫及代谢过程，对中枢神经系统和外周神经系统都存在广泛的影响。此外有研究证实缺氧诱导因子1(HIF-1)信号通路与神经干细胞的功能密切相关[12]，HIF-1通过调控其靶点的表达来适应不同的氧气水平，精确的氧气浓度控制也为神经系统疾病的治疗提供了新的切入点[13]。贺锐等[14]研究表明，钙信号通路能够调节Ca2+介导的突触后膜去极化，使内源性大麻素与突触前膜大麻素1型(CB1)受体结合，从而对抗神经元过度兴奋。脂肪水解酶1(FAAH1)是一种内源性大麻素水解酶，其可在神经系统和肝脏中表达，研究表明[15]，FAAH1抑制剂能够抵抗海人酸诱导的海马神经元兴奋毒性，显著减少大鼠的癫痫行为。可见FAAH1的适当抑制和抗内源性大麻素信号通路协调作用可以有效抑制癫痫疾病的发作。僵蚕息风止痉归肝经的理论与本研究结果不谋而合，证实了预测实验的准确性。

本研究通过网络分析平台，系统地研究了僵蚕抗惊厥作用机制，构建了僵蚕“活性成分-靶点-通路-疾病”网络，为临床治疗惊厥提供了参考。