新生儿人双埃柯病毒的检测及遗传特性分析

李红，唐炜，吕进泉

(江苏大学附属医院儿科，江苏 镇江 212001)

双埃柯病毒属(parechovirus)被分为A、B、C、D、E、F 6种，其中parechovirus A又叫人双埃柯病毒(human parechovirus，HPeV)，被细分为HPeV-1至HPeV-19基因型。HPeV是一种无包膜的病毒，其单链正向RNA基因组长度约为7.35 kb，包括1个开放阅读框(open reading frame，ORF)[1]。HPeV在儿童中广泛流行，可在多种儿童疾病(皮疹、脑炎、脑膜炎、脓毒症，甚至严重的扩张型心肌病)中检测出该病毒[2]。近年来，HPeV引起新生儿神经系统感染及败血症病例报告逐渐增多[3-5]，研究表明HPeV可能与婴幼儿神经系统发育延迟相关[6]。

感染HPeV的儿童可表现为非特异性症状或无症状，常在病原检测时发现。目前病毒感染主要依据实验室检测，包括病毒抗体检测、PCR及病毒培养等技术，主要针对已知病毒检测，对于新病毒及高度变异病毒具有一定局限性。HPeV基因组高度可变，给临床检测工作带来一定的困难。

病毒宏基因组学方法可以获得样本中所有的病毒核酸，具有了解样本病毒群落组成以及探索新病毒和高度变异病毒的优势[7]。本研究采集新生儿粪便样本，利用病毒宏基因组学方法检测HPeV，并对HPeV分子特性进行初步研究。利用巢氏PCR对新生儿粪便、血液及鼻咽分泌物进行HPeV检测，分析HPeV在新生儿中的流行情况。

1 资料与方法

1.1 临床资料

选取2018年9月至2018年12月在江苏大学附属医院产科出生的新生儿195例：早产儿18例，足月儿177例；采集样本时新生儿日龄3～7 d 60例， 8～14 d 72例，15～28 d 63例；其中男105例，女90例。

1.2 样本采集

使用一次性无RNA酶离心管采集新生儿粪便、血液及鼻咽分泌物样本各95份，储存于-80 ℃冰箱。在获得每位新生儿父母的知情书面同意后采集样本。

1.3 病毒宏基因组文库构建

随机选取45份粪便样本，运用病毒宏基因组学技术构建文库，将45份样本随机分为5组，每组9个样本，文库名分别标记为newbornfeces38、newbornfeces39、newbornfeces40、newbornfeces41以及newbornfeces42。病毒宏基因组DNA文库构建及生物信息学分析方法参考文献[8-9]。

1.3.1 DNA文库构建 从-80 ℃冰箱中取出样本置于冰上备用，用杜氏磷酸缓冲液将样本按照1 ∶5比例重悬，冰上静置10 min，期间振荡3次，12 000×g、4 ℃离心5 min。取300 μL上清液至新的1.5 mL 离心管中，保存待用。将各个文库中每个样本取100 μL制备成500 μL混合体系，用0.45 μm滤菌器(美国Millipore 公司)过滤悬液，以去除真核细胞、细菌及微小颗粒物质。利用核酸酶(美国Life Technologie公司)去除各文库中无衣壳蛋白保护的游离核酸，用核酸提取试剂盒(德国Qiagen公司)提取病毒核酸，使用文库RNA逆转录试剂盒(美国Life Technologic 公司)进行逆转录反应，将文库中的RNA逆转录为cDNA，然后使用Klenow 大片段DNA 聚合酶(美国New England Biolabs 公司)将单链DNA合成双链DNA，使用Viral metagenomics试剂盒(美国Illumina公司)构建DNA文库。

1.3.2 文库纯化与深度测序 将制备完成的DNA文库利用文库接头试剂盒(美国Illumina 公司)加上接头后进行扩增，接着采用Qiaquick PCR纯化试剂盒(德国Qiagen公司)对扩增后的PCR产物进行纯化并采用Ampure Beads(美国Beckman公司)除去文库中小的DNA片段和引物二聚体，从而获得长度在300～800 bp的DNA文库，送至上海生工生物有限公司Illumina Hiseq测序平台进行深度测序。

1.3.3 生物信息学分析 通过Hiseq平台对文库进行测序，运用病毒宏基因组学实验分析平台对测序所得的原始数据进行生物信息学分析。根据各样品条码将原始数据进行分类并输出，利用Bowite 2软件除去真核及原核基因序列，再利用VecScreen软件剪切掉序列两端的引物和接头，将纯净的序列组装拼接形成重叠群，进行BlastX搜索，从本地病毒蛋白数据库和本地非病毒蛋白数据库中进行检索。

1.4 全基因组获取

选取文库原始数据中病毒较长重叠群作为参考序列，利用Geneious 11.1.2软件在各个文库原始数据中进行组装，从而获取全基因组。

1.5 获得的HPeV毒株系统发育及重组分析

从GenBank数据中检索了44条与本研究鉴定的HPeV相关且具代表性毒株的全基因组进行系统发育分析。使用Mega 7.0进行序列多重比对，以及MrBayes 3.2.7软件进行系统发育分析。

从GenBank中检索相关基因组，并使用Mega 7.0进行序列多重比对，再使用RDP4.0评估重组事件[10]。通过软件SimPlot 3.5.1中的相似图分析所识别的基因组涉及的重组事件[11]。根据重组区域再次进行系统发育分析，确定重组事件。

1.6 HPeV阳性样本PCR筛查

依据上述研究获得的重组HPeV毒株的衣壳蛋白核酸序列，使用Geneious 11.1.2设计巢式 PCR引物，对构建文库的粪便样本45份以及其他新生儿鼻咽分泌物样本95份、血液样本95份、粪便样本50份，共285份样本进行阳性筛选。外套上游：ACCAGACTGGGTCATTGAG；外套下游：CCTTGCAAGAAG-GCGACAAC；内套上游：ACCCTTAGTCAACACCAGGC；内套下游：GGACAGACAAGCAGTGGTCA。外套PCR条件：94 ℃预变性2 min，随后94 ℃变性20 s，50 ℃退火 20 s，72 ℃延伸30 s，共35个循环，72 ℃延伸10 min。内套PCR条件：94 ℃预变性2 min，随后94 ℃变性20 s，55 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，共25个循环，最后72 ℃延伸10 min。1%琼脂糖凝胶电泳目的片段位于306 bp。

2 结果

2.1 病毒宏基因组文库生物信息分析

通过生物信息学分析，成功获得5个文库的病毒核酸序列，文库newbornfeces38至newbornfeces42分别检测出248 534、277 432、398 756、475 408、130 634条病毒序列，将原始数据上传至NCBI 的序列读长档案(sequence read archive，SRA)数据库，登录号为SRX7061110、SRX7063036、SRX7067008、SRX7070136、SRX7070288。在文库newbornfeces40和newbornfeces41分别检测630和1 792条HPeV序列。将文库newbornfeces41的原始序列进行组装，获得长度为7 207 bp的完整基因组，命名为newborn_zjlh，并预测该基因组包含一个编码多聚蛋白的ORF。已将其全基因组序列上传至 GenBank，登录号为MT157224。

2.2 HPeV全基因组分析

HPeV毒株基因组全长为7 207 bp，线性，两端为非编码区，GC含量39.7%，包含一个长度为6 540 bp的ORF，起始于639 bp止于7 178 bp，预测编码由2 179个氨基酸组成的多聚蛋白。P1、P2、P3是组成HPeV 多聚蛋白的3个多肽(图1)。

5′UTR: 5′端非编码区；3′UTR：3′端非编码区；RdRp：依赖于RNA的RNA聚合酶

2.3 HPeV系统进化分析及重组分析

基于HPeV全基因组的系统发育分析表明，来自新生儿粪便的HPeV属于HPeV-1，与其他HPeV-1紧密聚类在一起(图2A)。用newborn_zjlh不同区域基因序列进行BlastN，结果显示P1和P2基因区与HPeV-1关系密切，而P3基因区序列与HPeV-5同源性最高，提示newborn_zjlh可能是基因型间重组的结果。重组分析结果证实newborn_zjlh是HPeV-1 和 HPeV-5基因间重组的结果(图2B)。基于不同区域的系统发育分析进一步证实了这一结果，以P1和P2区域为基础的系统发育分析显示newborn_zjlh聚集在HPeV-1组中(图2C、D)，以P3区域为基础的系统发育分析显示newborn_zjlh与一株HPeV-5密切相关(图2E)。为了计算并验证重组区域的界限，利用Geneious 11.1.2软件，将newborn_zjlh全基因组作为参考序列，结合文库 newbornfeces41原始序列重新组装，发现重叠群覆盖边界以及产生的序列(图3)完全覆盖newborn_zjlh全基因组，这表明newborn_zjlh毒株重组事件是在新生儿粪便中自然发生。

2.4 HPeV阳性样本筛查

对粪便、血液及鼻咽分泌物样本进行巢氏PCR及1%琼脂糖凝胶电泳，结果显示6份粪便样本出现目的条带，PCR产物测序结果经BlastN验证均为HPeV。HPeV在新生儿消化道感染率为6.3%。

3 讨论

目前研究认为HPeV是婴幼儿感染的常见病原。HPeV主要通过粪便-口腔和呼吸道途径传播[12]，常在呼吸道分泌物及粪便样本中检测到该病毒[13]。本研究在95例新生儿粪便中检出6例HPeV阳性(6.3%)，并获得一个具有代表性的全基因组，分析显示其在HPeV-1和HPeV-5基因型间重组。基因重组是导致HPeV遗传多样性的一个常见原因[14]，本研究也证实这种进程在人体可自然发生。HPeV-1和HPeV-5在世界各地广泛流行，儿童腹泻和肠胃炎中检出率较高[15]。同时，有临床研究证实，HPeV-1和HPeV-5与3岁以下儿童的散发性瘫痪病例相关[16]。分析6例HPeV阳性新生儿临床资料，并没有肠道感染症状及神经系统感染证据。此次鉴定的HPeV毒株的致病性是否与HPeV-1或HPeV-5相同，还有待进一步研究。此外，有研究报道，婴幼儿早期感染HPeV与其3岁时的行为问题相关[17]，并在3个先天性畸形的婴儿中检测出HPeV[18]。因此，应观察并追踪新生儿期感染HPeV的危害及其与婴幼儿疾病的相关性。同时，对母婴合并感染HPeV的情况进行研究也是有必要的。

A：基于本研究鉴定的newborn_zjlh和其他具有代表性毒株的全基因组进行的系统发育分析；B：分析newborn_zjlh基因组与相关毒株基因组的重组结果；不同的颜色代表推定的重组区；C、D、E：基于不同重组区域基因序列构建的系统发育分析

A：newborn_zjlh全基因组碱基序列与原始序列进行组装后产生的序列；B：newborn_zjlh全基因组碱基序列；C：文库 newbornfeces41原始序列图3 HPeV原始序列映射至newborn_zjlh全基因组

本研究获得一株HPeV毒株基因组，系统发育分析显示，它与HPeV-1聚类。重组分析显示其基因是重组而成，基因组全长7 207 bp，GC含量39.7%，包含一个长度为6 540 bp的ORF。利用ORF在GenBank进行BlastP比对，与其同源性最高的5株 HPeV-1来自中国不同地区(GenBank号：AID67141、AMR08592、AMR08588、AOT85832、AQX36833)，且均从人体样本检出。本研究在调查血液及呼吸道样本时未检测出HPeV。已有研究表明，在呼吸道感染性疾病儿童中，HPeV检出率可达8.8%[18]。这与本研究结果差距较大，推测其可能与新生儿接触外部环境时间及空间受限相关。

本研究显示HPeV可在新生儿中流行，而且主要是肠道感染，其危害性尚需进一步追踪观察。