品质异常全脂灭菌乳中芽胞杆菌的分离鉴定

2021-09-16陈荟旭潘姣姣桂成坤孙鹏亮张秋林魏鑫豪李莲瑞

中国乳品工业 2021年8期

陈荟旭，潘姣姣，桂成坤，孙鹏亮，张秋林，魏鑫豪，李莲瑞

（1.塔里木大学动物科学学院，新疆阿拉尔843300；2.塔里木畜牧科技兵团重点实验室，新疆阿拉尔843300；3.新疆生产建设兵团塔里木动物疫病诊断与防控工程实验室，新疆阿拉尔843300）

0 引言

芽胞杆菌是一类好氧或兼性厌氧[1-2]、能产生内生胞子并具有繁殖快速、生命力极强等特性的革兰阳性菌。该菌广泛分布于土壤、水、空气、动物肠道和植物体内[3-5]。如今乳制品受到广大消费者的青睐，国家对其质量安全要求更高，牛乳在严格的加工流程中经杀菌处理后，有些耐热性芽胞仍可能残留于乳中或在其它生产环节被芽胞杆菌污染，受到污染的乳制品被消费者食用后严重的可能危及生命。根据各国的研究调查表明，污染乳制品的细菌大多都是芽胞杆菌。生庆海[6]等研究了灭菌乳中芽胞杆菌产酶与乳品质的关系，发现了芽胞杆菌的酶能水解乳蛋白，产生蛋白变性，使酸度提高、产生沉淀等。陈霞[7]等人研究了耐热芽胞杆菌的最适生长温度，并对芽胞杆菌经过不同温度热处理后的活性进行了研究。本实验拟从品质异常的全脂灭菌乳中分离芽胞杆菌，并对其进行一些研究和分析，希望找到污染此类乳制品的芽胞杆菌。

1 试验材料

1.1 样品来源

异常全脂灭菌乳（异常现象为：味道微苦，有蛋白凝集、沉淀，微有涨袋），由南疆某乳品企业提供，取回后4℃保存备用，用于分离异常全脂灭菌乳中的芽胞杆菌。

1.2 试验药品

氯化钠，氢氧化钠，无水乙醇，结晶紫，草酸铵，碘，碘化钾，丙酮，番红，孔雀石绿，蛋白胨，酵母粉，琼脂，琼脂糖，核酸染料，溶菌酶，甘油，锰盐营养琼脂，普通营养琼脂，嗜冷菌计数琼脂，DNA maker，氨苄青霉素（Ampicillin Na）。

1.3 试剂和仪器

95%乙醇溶液，结晶紫溶液，碘液，0.5%的番红乙醇溶液，1%氢氧化钠溶液，饱和孔雀绿溶液，无菌水。恒温培养箱，上海一恒科学仪器有限公司；高压锅，日本TOMY KOGYO公司；小型台式高速离心机，Eppendorf公司；小型高速冷冻离心机，Eppendorf公司；微波炉，格兰仕微波炉电器有限公司；洁净工作台，上海博讯实业有限公司；显微镜，日本尼康株式会社；微量移液器，Thermo科技有限公司；水浴锅，上海博讯实业有限公司；摇床，上海智城分析仪器制造有限公司；加热制冷循环器，德国JULABO Laborteckmik G mbh。

2 实验方法

2.1 异常全脂灭菌乳中芽胞杆菌的筛选、分离、纯化

取样：袋装全脂灭菌乳（利乐包），洁净工作台内无菌操作将乳样分装到无菌250 mL锥形瓶中100 mL。

接种：将取出乳样80℃水浴20 min，水浴后用无菌蒸馏水倍比稀释5个梯度，涂布法分别接种于锰盐营养琼脂55℃培养和普通营养琼脂37℃培养24～48 h，嗜冷菌计数琼脂5℃培养5～7 d，倒置于恒温培养箱培养。

纯培养：观察培养的细菌形态，选取单菌落于不同培养基上划线培养。

对纯培养的细菌进行制片，革兰染色和芽胞染色和镜检，筛选：选取单菌落中有芽胞的菌体，接种于装有8 mL液体培养基的细菌瓶中摇菌扩增，用于DNA提取。

2.2 异常全脂灭菌乳中芽胞杆菌DNA的提取

取扩菌后的细菌1 mL于1.5 mL的无菌离心管内，12000 rpm离心1 min，弃上清，重复一次，收集适量细菌。细菌DNA提取方法按照北京全式金生物技术有限公司DNA提取试剂盒（M 10208）说明书进行操作。提取的DNA于-20℃保存备用。

2.3 异常全脂灭菌乳中芽胞杆菌16S rDNA克隆的质粒鉴定

2.3.1 对PCR产物切胶回收

按照北京全式金生物技术有限公司胶回收试剂盒（L41118）说明书进行操作，回收的DNA于-20℃保存备用。

2.3.2 目的基因与连接T载体

回收的PCR产物连接到p MD-19T载体上，于加热制冷循环器16℃连接过夜。连接反应体系反应液组分16SrDNA片段0.5μL、p MD-19T Vector 3.5μL、Solution I 6μL。

2.3.3 转化克隆和菌液PCR鉴定

将连接物7μL加入到100μL感受态细胞DH 5α中，冰浴30 min，42℃热冲击90 s，再置于冰中1 min，加入含Amp+（50μg/m L）的LB液体培养基900μL，37℃，200 rpm振荡培养1 h，取转化菌100μL使用涂菌珠涂布于含有Amp+（50μg/mL）的琼脂平板培养基上，培养12 h，培养出细菌后，挑取单菌落，于含Amp+（50μg/m L）的LB液体培养基中过夜培养，用菌液做PCR（细菌通用引物序列如下：27F：5'-AGAGT TTGATCCTGGCTCAG-3'和1492R-5'-CGGTACCTTGTTACGACTT-3'进行PCR扩增。PCR扩增体系为：DNA模拟1μL；上游引物和下游引物各0.5μL；EasyTaq SuperMix12.5μL，加入dd H2O补至25μL。PCR扩增程序为：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，55℃退火30 s；72℃延伸90 s；35个循环；72℃再延伸10 min。PCR产物径1%琼脂糖凝胶电泳后观察是否有目的条带。扩增芽胞杆菌16s rDNA的序列），1%琼脂糖电泳后，观察条带大小。

2.3.4 提取质粒与质粒电泳鉴定

提取质粒按照天根生化科技有限公司的高纯度质粒小提试剂盒说明书进行操作。取20μL质粒与p MD-19T Vector自连，经1%琼脂糖电泳后，察看电泳条带大小。

2.3.5 测序

对于菌液PCR结果为阳性的克隆细菌，提取其质粒，送测序。

2.3.6 序列分析

将测序序列在NCBI上进行核苷酸序列比对，判定该芽胞杆菌的种属。

3 结果与分析

3.1 品质异常全脂灭菌乳中芽胞杆菌的筛选、分离、纯化结果

将异常酸牛乳样于80℃水浴20 min，水浴后分离得到单菌落，经革兰染色，初步鉴定为芽胞杆菌后，将细菌纯化后培养结果见图1。菌落形态：菌落小，淡黄色，圆形，隆突，有光泽，半透明。

图1 异常全脂灭菌乳中芽胞杆菌

3.2 异常全脂灭菌乳中芽胞杆菌的染色结果

异常全脂灭菌乳中芽胞杆菌D革兰染色结果见图2。

图2 异常全脂灭菌乳中芽胞杆菌革兰染色1000×

异常全脂灭菌乳中芽胞杆菌D经过芽胞染色以后，结果见图3。

图3 异常全脂灭菌乳中芽胞杆菌芽胞染色1000×

3.3 异常全脂灭菌乳中芽胞杆菌的基因组提取结果

将液体培养基中过夜培养的芽胞杆菌D，使用全式金DNA提取试剂盒（M 10208）提取DNA后，经1%琼脂糖电泳后，结果如图4。由图可以看出，芽胞杆菌D的基因组提取成功。

图4 细菌基因组的电泳结果

3.4 异常全脂灭菌乳中芽胞杆菌的的16S rDNA扩增结果

提取芽胞杆菌D基因组DNA，用细菌通用引物16SrDNA对其扩增，PCR产物1%琼脂糖凝胶电泳结果见图5。

由图可以看出，使用细菌16S rDNA通用引物序列扩增出了芽胞杆菌D的16S rDNA基因大小约为1500 bp，与预期大小相符。

3.5 异常全脂灭菌乳中芽胞杆菌的16S rDNA克隆质粒的鉴定结果

将16S rDNA片段和p MD-19T Vector连接产物转化到大肠杆菌DH 5a，涂布于含有Amp+（50μg/mL）的琼脂平板培养基上，培养12 h，培养出细菌后，挑取单菌落，于含Amp+（50μg/mL）的LB液体培养基中过夜培养，提取大肠杆菌的质粒，经1%琼脂糖电泳，PMD-19T Vector自连为对照，结果如图6。

图6 16SrDNA克隆质粒的鉴定结果

由图可看出，克隆出的16S rDNA基因大小为1500 bp左右，与筛选出的芽胞杆菌的16S rDNA基因大小相同，该阳性克隆可送测序。

3.6 异常全脂灭菌乳中芽胞杆菌的16S rDNA的测序结果

细菌D的序列如下：

3.7 序列分析结果

将测序序列在NCBI上进行核苷酸序列比对，判定该芽胞杆菌的种属，比对结果见表1。

表1 异常全脂灭菌乳中芽胞杆菌序列比对结果

3.8 短小芽胞杆菌系统发育树的构建及分类

将其结果提交到NCBI数据库进行核酸比对，建立进化树后分析表明，该菌株与登录号为KR 780437、KU 662344、KU 662334、MT 052639、KU 681229、JN 578480、MN 704393的短小芽胞杆菌处于同一分支，且根据同源性分析，该菌株与登录号为KR 780437、KU 681229、MN 704393、JN 578480的短小芽胞杆菌的同源性为100%，根据以上结果，可以确定该菌株为短小芽胞杆菌。进化树分析结果和同源性比较如下，见图7～8。

图7 短小芽胞杆菌进化树

图8 同源性分析

4 讨论

芽胞杆菌在恶劣环境条件下，脱水形成休眠体芽胞。芽胞的结构复杂，最里面为核芯，含原生质体，被芽孢膜所包裹。由于芽孢的多层结构，其对热、干燥和其他理化因素具有较强的抗性，灭杀的要求更苛刻。因此乳制品生产过程中,可能存在芽胞杆菌经热处理后没有被杀死,随生产流程进入管道，管道中乳制品营养较丰富,这些细菌形成生物膜包裹自身[8]，随着生产线进入下一生产阶段直至生物膜成熟后释放包裹的芽胞杆菌污染整个乳制产品[9]。韩永霞[10]研究发现经过超高温瞬时灭菌的制品中依然存在地衣芽胞杆菌、嗜热脂肪芽胞杆菌、枯草芽胞杆菌等嗜热芽胞杆菌的污染，王林林[11]以5种不同品牌的瞬时高温灭菌牛奶为研究样本，从中分离鉴定出短小芽胞杆菌、枯草芽胞杆菌、地衣芽胞杆菌和蜡样芽胞杆菌等。短小芽胞杆菌能代谢产生碱性蛋白酶、脂肪酶和胶原蛋白酶等，在牛奶营养琼脂上形成透明的水解圈，是一种能引起食源性疾病的腐败菌[12]，刘润身[13]在乳品污染水中分离出蛋白降解菌，鉴定为短小芽胞杆菌，该菌对乳品的危害较大，却未见有该菌引起食物中毒报道，可能是该菌污染食品的几率小。本实验在灭菌乳中检测出短小芽胞杆菌，却未见原料乳中存在，说明该菌是在UHT杀菌后污染进入乳品中的，可能存在该菌的环节是冷却和灌装环节。康博燕[14]调查了乳品生产环境中微生物，短小芽胞杆菌存在于乳品加工车间的灌装间和外包装车间。控制该芽胞杆菌的污染乳制品，应提高乳品加工车间及生产设备的清洗消毒程度。本实验从异常全脂灭菌乳中分离鉴定出了短小芽胞杆菌。