白细胞介素-23在急性肝损伤模型中调控Kupffer细胞M1型极化的作用机制

华男 方莹 张芳芳 桑建忠

肝脏是人体重要的代谢和消化器官，也是清除肠道源性细菌和内毒素的场所，肝脏的免疫调节功能主要是靠Kupffer细胞起作用的。Kupffer细胞是一种肝脏独有的巨噬细胞[1-2]，经脂多糖（LPS）激活可以导致肝脏炎症和全身炎症反应。Kupffer细胞的激活常常受到肠道菌群、微生物代谢物、内毒素等的影响，同时也和肝脏中的肝细胞、星形细胞以及其他免疫细胞有关[3-4]。Kupffer细胞发挥了重要的炎症免疫调节作用，可以发生极化，而极化状态不同可使其起不同的作用，在肝损伤中M1型极化的巨噬细胞主要发挥促炎作用[5-6]，且M1型细胞可以由LPS诱导产生，但是其极化的机制以及复杂的诱导因素尚未被完全揭示。

IL-23是一种致炎性的细胞因子，目前已经发现其在银屑病等疾病中表达增高，同时与疾病的发生、发展有关[7-8]。而IL-23在肝损伤中的表达以及作用机制尚未见报道，由于M1型细胞的激活和炎症因子及信号激活有关，因此本文旨在探究IL-23在急性肝损伤模型中调控Kupffer细胞M1型极化的作用机制。

1 材料和方法

1.1 主要试剂 Kupffer细胞购自武汉普诺赛生物技术有限公司；抗IL-23抗体购自美国Abcam公司；佛波酯（PMA）、LPS和重组人 IFN-γ均购自美国 Sigma公司；藻红带白（PE）标记的抗-F4/80抗体（PE-F4/80）、异硫氰酸荧光素（FITC）标记的 CD11c+抗体（FITC－CD11c+）均购自美国Invitrogen Bioscience公司；HE染色试剂盒购自北京索莱宝生物科技技术有限公司；免疫组织化学染色试剂盒购自上海生工有限公司；一氧化氮合酶（iNOS）、TNF-α、IL-6的 ELISA 试剂盒均购自南京建成生物工程研究所；JAK1、STAT1 以及 p-JAK1、p-STAT1 的单克隆抗体（一抗）和辣根过氧化物酶标记的IgG抗体（二抗）均购自美国Abcam公司；四氯化碳购自美国Merck公司；BCA试剂盒及 ECL试剂盒均购自上海碧云天生物技术公司。

1.2 实验用动物 40只雄性8周龄清洁级小鼠[C57BL/6，体质量为（24.54±3.11）g]购自浙江中医药大学动物实验中心，分笼饲养，5只/笼。饲养温度为20～25 ℃，湿度（70±5）%，自由活动、摄食。

1.3 方法

1.3.1 诱导Kupffer细胞分组及M1型极化 取对数生长期Kupffer细胞分为IL-23+anti-IL-23组、IL-23组和对照组，以106个/孔接种到6孔板中，加入200 ng/ml的PMA诱导刺激6 h，之后加入1 μg/ml的LPS和20 ng/ml的IFN-γ进行诱导；IL-23组加入20 ng/ml的IL-23，而IL-23+anti-IL-23组中除了加入20 ng/ml的IL-23外还同时加入20 ng/ml的anti-IL-23，培养24 h。

1.3.2 M1型细胞比例检测 采用流式细胞术。取上述培养细胞，用PBS洗2次，调整细胞浓度为107个/ml，将细胞悬液加入Eppendoff管中，并加入PE-F4/80和FITC－CD11c+标记Kupffer细胞，混匀后避光孵育30 min，PBS洗2次后加入200 μl的Binding缓冲液，上机检测。

1.3.3 Kupffer细胞 iNOS、TNF-α、IL-6水平检测 采用ELISA法。取上述培养细胞，3 000 r/min离心15 min后取上清液，参照试剂盒说明进行操作。

1.3.4 Kupffer细胞 JAK1、p-JAK1、STAT1 及 p-STAT1蛋白表达水平检测 采用Western blot法。取上述培养细胞，NP-40裂解液冰上裂解30 min，收集裂解液离心，采用BCA试剂盒进行蛋白质定量，调整蛋白质浓度后进行SDS-PAGE凝胶电泳，转膜后使用封闭液封闭，加入一抗4℃下孵育过夜，TBST洗2次后，二抗孵育，经过化学发光ECL试剂盒反应后显影，采用Image J软件进行灰度值分析。

1.3.5 急性肝损伤小鼠模型的构建及分组 40只小鼠采用掷骰子随机法分为anti-IL-23组、IL-23组、模型组及对照组。用四氯化碳诱导小鼠构建肝损伤模型[14]。建模后anti-IL-23组小鼠尾静脉先注射50 ng/ml的IL-23 溶液 100 μl，再注射 50 ng/ml的 anti-IL-23 溶液100 μl；IL-23 组小鼠尾静脉注射 50 ng/ml的 IL-23 溶液100 μl；模型组小鼠仅构建肝损伤模型；对照组小鼠不作任何处理。

1.3.6 小鼠肝脏组织中 iNOS、TNF-α、IL-6水平检测 上述处理完24 h后，二氧化碳窒息法法处死4组小鼠，取小鼠外周血，参照ELISA试剂盒说明书进行检测。

1.3.7 小鼠肝脏组织中CD11c+表达水平检测 采用免疫组织化学染色法。取小鼠肝脏组织使用4%的中性多聚甲醛固定，石蜡包埋后连续切片（4 μm），经过脱蜡、内源性过氧化物酶消除、热修复抗原、封闭、CDI68孵育、二氨基联苯胺显色后观察，以PBS代替第一抗体作为阴性对照。

1.3.8 小鼠肝脏组织病理变化检测 取小鼠肝脏组织使用4%的中性多聚甲醛固定，石蜡包埋后连续切片（4 μm），按照HE染色试剂盒操作。

1.3.9 小鼠肝脏组织中 JAK1、p-JAK1、STAT1及 p-STAT1蛋白表达水平检测 采用Western blot法。取小鼠肝脏组织，使用无菌剪剪碎后液氮下研磨至无颗粒状，加入PMSF的NP40细胞裂解液，冰上裂解30 min后，3 000 r/min离心30 min，取上清液，采用BCA试剂盒进行蛋白质定量，调整蛋白质浓度后进行SDS-PAGE凝胶电泳，PVDF转膜后使用封闭液封闭，加入单克隆抗体4℃下孵育过夜，TBST洗2次后，二抗孵育，经过化学发光ECL试剂盒反应后显影，采用Image J软件进行灰度值分析。

2 结果

2.1 3组Kupffer细胞M1型细胞比例比较 结果显示IL-23组中M1型细胞的比例为（12.05±1.32）%，而IL-23+anti-IL-23组中M1细胞的比例为（7.55±1.08）%，对照组中M1型细胞的比例为（8.32±1.32）%，IL-23组明显高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05），见图1。

图1 3组Kupffer细胞M1型细胞的流式细胞图

2.2 3 组 Kupffer细胞 iNOS、TNF-α、IL-6 水平比较IL-23组的iNOS、TNF-α、IL-6水平均明显高于对照组，差异均有统计学意义（均P＜0.05），而IL-23+anti-IL-23组的iNOS、TNF-α、IL-6水平均明显低于IL-23组，差异均有统计学意义（均P＜0.05），见表1。

表1 3组 Kupffer细胞 iNOS、TNF-α、IL-6 水平比较（pg/ml）

2.3 3 组 Kupffer细胞 JAK1、p-JAK1、STAT1 以及 p-STAT1蛋白表达水平比较 IL-23组的JAK1、p-JAK1、STAT1以及p-STAT1蛋白表达水平均明显高于对照组，差异均有统计学意义（P＜0.05）；而IL-23+anti-IL-23组的JAK1、p-JAK1、STAT1以及p-STAT1蛋白表达水平均明显低于IL-23组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。见图 2、表 2。

表2 3组Kupffer细胞JAK1、p-JAK1、STAT1以及p-STAT1蛋白表达水平比较

图2 3组 Kupffer细胞 JAK1、p-JAK1、STAT1以及 p-STAT1蛋白表达的电泳图

2.4 4组小鼠肝脏组织中iNOS、TNF-α、IL-6水平比较对照组iNOS、TNF-α、IL-6水平均较其余3组低，差异均有统计学意义（均P＜0.05）；而模型组iNOS、TNF-α、IL-6水平均较IL-23组、anti-IL-23组低，差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表3。

表3 4组小鼠肝脏组织中 iNOS、TNF-α、IL-6 水平比较（pg/ml）

2.5 4组小鼠肝脏组织中CD11c+表达情况及肝脏组织病理变化比较 对照组小鼠肝组织中未见CD11c+的表达，而模型组小鼠CD11c+表达明显，IL-23组小鼠CD11c+的表达较模型组更为明显，见图3（插页）。对照组小鼠肝组织无明显损伤，无细胞炎症反应，呈正常生理状态；而模型组小鼠肝组织出现明显的炎症反应和细胞损伤；IL-23组小鼠肝组织损伤较模型组明显；而anti-IL-23组小鼠肝组织损伤较IL-23组减轻，见图4。

图3 4组小鼠肝组织免疫组织化学染色结果（×200）

图4 4组小鼠肝组织HE染色结果（×200）

2.6 4组小鼠肝脏组织中JAK1、p-JAK1、STAT1及p-STAT1蛋白表达水平比较 与对照组比较，IL-23组、模型组JAK1、p-JAK1、STAT1及p-STAT1蛋白表达水平均明显升高，差异均有统计学意义（均P＜0.05）；anti-IL-23 组、IL-23 组 JAK1、p-JAK1、STAT1 及 p-STAT1蛋白表达水平与模型组比较差异均有统计学意义（均 P＜0.05）。见图5、表4。

图5 4组小鼠肝脏组织中JAK1、p-JAK1、STAT1及p-STAT1蛋白表达的电泳图

表4 4组小鼠肝脏组织中JAK1、p-JAK1、STAT1及p-STAT1蛋白表达水平比较

3 讨论

肝损伤是一种发病机制较为复杂的肝脏疾病。Kupffer细胞组成单核-巨噬细胞系统的一群特殊细胞，在肝脏免疫中发挥着重要的作用。肝脏微环境是由肝细胞、基质细胞以及免疫细胞组成的[9-10]，Kupffer细胞主要来源于血液中的单核细胞，在不同细胞因子刺激下形成不同的亚型。M1型细胞是由IFN-γ、LPS刺激形成的，可以分泌IL-1、IL-6、IL-12等[11-12]。M1型具有较高的抗原提呈能力，可激活免疫反应，保护机体免受感染，所以M1型细胞也被称为是促炎的Kupffer细胞。目前也有研究发现M1型Kupffer细胞在多种肝脏炎症反应中发挥着重要的作用[13-14]。而M2型可以被IL-4、IL-10等刺激形成，其高表达CD163和CD206，具有抑制免疫应答、促进肿瘤血管生成、诱导组织重构等作用，同时可发挥抑制炎症反应的作用。

M1型细胞在肝损伤中起到重要的作用，而前期研究也发现IL-17A参与了M1型细胞的激活，在非酒精性脂肪性肝病中发挥着重要的作用[15]。IL-23也是一种重要的炎症因子，已有的研究发现在乙型肝炎患者中Th17细胞比例上调，同时IL-23和IL-6水平上调，且炎症因子和ALT、AST的表达呈正相关[16]，说明IL-23与肝炎的进程有关，但其确切的机制未明。为了进一步明确其机制，本研究采用LPS+PMA+IFN-γ诱导Kupffer细胞M1极化，同时添加IL-23观察其对于M1细胞极化的影响，LPS+PMA+IFN-γ是经典的诱导巨噬细胞极化的方法，结果显示在此基础上添加IL-23可以协同刺激Kupffer细胞的极化，这种变化是明显的，而进一步添加anti-IL-23抗体后这种作用被抑制，说明IL-23确实促进了M1极化。JAK1-STAT1信号是M1极化的经典信号。本研究结果证明，IL-23刺激了JAK1和STAT1的磷酸化，进一步调控了信号的激活，同时可以提高M1型细胞标志物iNOS、TNF-α、IL-6的表达。为了明确其在组织中的作用，采用四氯化碳诱导小鼠急性肝损伤，在此基础上利用重组IL-23进行干预，结果证明IL-23可以进一步促进肝组织中M1型细胞的极化，同时增强了细胞组织的炎症反应，而添加anti-IL-23后可以抑制这种变化，其机制同样和JAK1-STAT1的激活有关。

综上所述，本研究结果证明，IL-23可以通过促进Kupffer细胞M1极化增强肝脏炎症性损伤。