“困难序列”多肽的合成方法

许小玲，张荣江，谢 欣，3，易小庆，3，陈伟铭，3，张 剑，3，江 峰，3

（1.赣南医学院2019级硕士研究生；2.赣南医学院药学院；3.心脑血管疾病防治教育部重点实验室，江西 赣州 341000）

多肽是由多种氨基酸通过肽键结合而成的一种生物活性物质，具有广泛的生物活性及良好的安全性，广泛应用于医药、食品、化妆品、农业及畜牧业等领域［1］。作为化学合成多肽的重要途径，固相合成因避免了液相合成中冗长的重结晶或分离步骤，减少了合成生产过程中的损失而得到了广泛的应用［2］。但是，对于一些含有较多疏水性氨基酸片段且容易出现β-折叠等二级结构的多肽仍然难以合成，尤其是出现在第6~16个氨基酸残基的“困难序列”［3］，几乎每一个氨基酸的脱保护和偶联都难以顺利完成，缺失肽和截头肽较多，收率很低。

目前解决多肽“困难序列”合成困难的方法有很多，包括使用混合溶剂、减少树脂担载量、使用高离液盐、片段缩合、引入化学修饰的肽链和采用微波技术合成等［4］。本文对“困难序列”形成的原因及其解决方法进行了综述，并总结了一些经典“困难序列”多肽固相合成的基本策略。

1 “困难序列”形成的主要原因

根据形成原因的不同，多肽“困难序列”可以分为随机和非随机两种类型［5］，随机型“困难序列”与氨基酸疏水性及立体位阻有关。当氨基酸的立体位阻较大（如氨基酸的侧链具有较大保护基）时，酰化试剂扩散困难；或树脂的负载量较大时，树脂上的肽链溶剂化不完全，偶联结果都很差［5］。随机困难肽可以通过疏水性参数来粗略表示［6］，现在仍没有一条“黄金规则”能准确预测。一般认为，当疏水性参数达到正数，其合成就相当困难［7］。非随机型“困难序列”是指易形成具有稳定且特异性β-折叠结构的肽链序列。该类序列的肽链在一定长度时很容易发生氢键缔合，且与树脂载体之间也容易出现分子聚集现象，多肽分子的氨基可能埋没在二级结构的深处，进而阻止缩合反应，此现象常出现在难溶多肽的合成中［4，8］。使用9-芴甲氧羰基（Fmoc）保护的氨基酸合成多肽时容易形成这种β-折叠结构，合成过程需要改变反应条件如提高温度等破坏这种构型，但这可能会导致产物消旋化或提前脱除Fmoc保护等不良反应［7］。

2 解决“困难序列”多肽合成困难的方法

解决“困难序列”多肽合成困难的方法有很多，可以从改变反应体系、改变反应条件、改变合成策略、采用新的合成技术手段等方面进行。

2.1 改变反应体系

2.1.1 使用混合溶剂多肽树脂在溶剂中达到充分溶胀状态时，有利于缩合反应的进行。当选用如N-甲基吡咯烷酮（NMP）、N，N-二甲基甲酰胺（DMF）、二甲亚砜（DMSO）、N，N-二甲基乙酰胺（DMAc）等受氢溶剂时，其羰基（C=O）与肽链上的N-H可以形成氢键，从而抑制了肽链自身形成氢键而造成的聚集，进而抑制β-折叠的生成。因此，选用合适的混合溶剂，比如DMSO/DMF、6N胍啶/DMF、异丙醇/DMF、二氯甲烷（DCM）/DMF/NMP、三氟乙醇（TFE）等有助于缩合反应的进行。黄惟德在《多肽合成》一书中提到，DMF为溶剂的反应液中加入20%体积的三氟乙醇（TFE）可帮助接肽速率提高［9］。朱亮亮等在大位阻氨基酸Fmoc-Arg（Pbf）-OH与Rink Amide-AM树脂的高效缩合中以DMAc/DCM为反应溶剂，连接率高达93%［10］。

2.1.2 使用溶胀性能更好的树脂当树脂的负载量较大时，树脂上的肽链溶剂化不完全，偶联结果很差［5］。使用溶胀性较好的树脂，同时减少树脂担载量，有利于“困难序列”多肽的合成。比如Winkler等在合成“困难序列”多肽K5（序列：CGGKVSALKEKVSALKEKVSALKEKVSALKEKVSA LKE）时，采用PEG-PS树脂代替常规的PS/DVB树脂，使得粗肽收率有了显著性提高［11］。然而，由于成本高昂，这种方法不适合于大规模的工业生产［12-13］。

2.1.3 选用高效缩合试剂选用高效缩合试剂，可以有效地促进缩合反应的顺利进行，也是解决“困难序列”多肽合成困难的一种常见方案，见图1。通常DIC的反应活性低于HBTU，HBTU的反应活性低于TBTU、PyBOP和HATU［14-15］。所以，在反应活性比较低的时候，可以选择高活性的缩合试剂。

图1 常见的高效偶联试剂

2.2 改变反应条件

2.2.1 提高反应温度提高反应温度有助于降低链聚合现象。BACSA B等［16］在合成1个九肽的实验中发现，将合成温度提高到60℃左右，最终产品的纯度可达到83%。然而，提高反应温度会导致新的不良反应的发生，比如侧链保护基的断裂［17］。所以，在尽可能减少不良反应的情况下，可以提高反应的温度。

2.2.2 调节反应p H值调节反应pH值能改变多肽在溶剂中的溶解度，从而提高“困难序列”多肽的合成效率。比如QIN X等［18］、AJIKUMAR PK等［19］研究了体系的pH值对多肽收率的影响，发现根据多肽序列中酸性和碱性氨基酸的数量，适当调节溶剂的pH值，可以提高肽链的溶解性，促进反应的进行。然而，由于在该pH值条件下，多肽保护基可能不稳定，所以不常使用［20］。

2.2.3 使用高离液盐高离液盐能破坏肽链间的氢键，从而破坏β-折叠结构，提高“困难序列”多肽的合成效率。常见的高离液盐有尿素、LiCl、NaClO4等。比如，WESTALL FC等［21］在合成“困难序列”多肽时，发现加入尿素之后可使Asn及Glu的缩合率由70%提高至100%。这可能是由于尿素具有受氢能力，干扰了肽链上的氢键缔合，从而促进了多肽的合成。然而，使用高离液盐会降低反应液的浓度，对反应速率有一定影响。

2.3 改变合成策略

2.3.1 片断合成法常规多肽固相合成，是从碳端开始按照氨基酸的顺序依次合成。当遇到“困难序列”时，采用片段合成法先制备带有保护基的中间序列片段，再经过进一步活化、缩合得到保护的多肽，最后脱去保护基得到目标多肽。片段合成要考虑多肽片段的长短、连接位点和固相载体这3个关键因素。由于肽段羧基端氨基酸比氨基端氨基酸更容易发生消旋反应，因此首先选择多肽片段C末端的氨基酸。适合做C末端的氨基酸有Gly（甘氨酸）、Pro（脯氨酸）、Glu（谷氨酸）、Leu（亮氨酸）和Asn（天冬酰胺）等［22］。周建华等［23］以王树脂为固相载体制得25-34肽树脂；以2-氯三苯甲基氯树脂为固相载体制得1-11、12-16和17-24等3个片段的全保护肽；然后将3个片段的全保护肽按照肽序依次缩合到25-34的肽树脂上，经三氟乙酸切割并脱除侧链保护基得特立帕肽粗品。SHIL等［24］采用片段合成法顺利地合成了阮病毒蛋白片段。张颖等［25］在合成含有3股β折叠的齐考诺肽（25肽，序列：CKGKG AKCSR LMYDC CTGSC RSGKC-NH2）的 过程中，采用固相合成得到4个片段，分别是［19-25］A、［12-18］B、［6-11］C和［1-5］D，再将B、C、D依次偶联到肽树脂A上，最后从树脂上裂解得到线形粗肽。该方法相对于传统的逐步缩合方法，缩短了合成周期，提高了粗肽的收率和纯度，为长肽的合成难题提供了可行性的解决方案。

2.3.2 引入化学修饰的肽链引入化学修饰的肽链，将“困难序列”多肽的高级结构暂时性破坏，促进肽的溶解，从而有利于多肽的合成。比如，当肽链中含有脯氨酸片段时，缩合形成的酰胺键没有可以形成氢键的质子，脯氨酸的α碳原子处在五元环的刚性结构中，从而抑制了β-折叠结构的形成，所以，在合成“困难序列”时可以考虑引入脯氨酸来减少合成的难度。WHITE P等［26］在合成一些较长多肽序列（95肽）的时候引入伪脯氨酸二肽结构（类似脯氨酸结构）保护氨基酸来改善聚集问题，见图2。Ser、Thr和Cys 3个氨基酸可以和序列中邻近的氨基酸形成一个伪脯氨酸二肽（fPro），肽链在树脂上组装完成后，放在TFA溶液中搅拌，将多肽从树脂上裂解下来，同时恢复正常的序列，不会影响多肽的性质［27-28］。

图2 伪脯氨酸（fPro）引入和脱除

2.3.3 氨基酸上引入取代基在氨基酸的氨基上引入不同取代基，可以改变合成过程中肽链的延伸方向，从而破坏肽链聚集现象，促进缩合反应的进行。TICKLER A K等在amyloid-β（含有40-43氨基酸残基）的固相合成中每6～7个氨基酸残基就引入1个2-羟基-4-甲氧基苄基（Hmb）保护基，肽链在树脂上组装完成后，将多肽从树脂上裂解下来，同时把Hmb取代基除掉得到产物（图3）［29］。OFFER等［30］引入Hmb类似物2-羟基-4-甲氧基-5-硝基苄基保护基，很好的提高了聚集肽等困难系列的合成效率。但是引入取代基需要对保护的氨基酸原料进行改进，操作不方便，成本很高。

图3 Hmb保护基的引入和脱除

2.4 采用新的合成技术手段微波合成、红外加热和超声辐射作为新的技术手段，表现出加热快速、均质与选择性好等特有优势，已被应用在“困难序列”多肽的合成中。HOJO K等［31］利用微波加热方法在水溶液中成功地合成了公认的“困难序列”酰基载体蛋白ACP（65-74）肽，克服了原有化学合成污染大、三废多的缺点，纯品收率达到38%。HOJOK等［32］证明微波辐射可以成功地提高亮氨酸-脑啡肽和聚集肽Val-Ala-Gly-OH的合成产率和纯度。MARO等研究了超声波对多肽固相合成的影响，发现超声辐射改善了具有“困难序列”的肽的合成，但并没有加剧主要的不良反应［33］。DERDA等提出了用红外加热的方式来促进“困难序列”的肽的合成［34］。利用这些新的技术手段合成多肽，能够极大地提高产物的产率及纯度，同时也为降低反应成本提供了可能性。

当上述单一方案不能达到目的时，WALJI等将提高反应温度、用微波或红外加热以及溶剂化聚乙二醇树脂联合使用，成功得到“困难序列”Omomyc［35］。

3 经典的“困难序列”多肽合成策略

3.1 胸腺法新的合成胸腺法新（胸腺肽α1）的序列为Ac-SDAAV-DTSSE-ITTKD-LKEKK-EVVEEAEN-OH，是一个28肽。主要用来治疗慢性乙型肝炎，具有良好的免疫调节作用［36］。胸腺法新的酸性残留位置、疏水性氨基酸的连续存在（Thr-Thr、Val-Val）和需要大量的保护基（20个侧链保护基）等造成了其固相合成的困难。采用Fmoc策略合成时，C端第1个氨基酸会用到Fmoc-Asn（Trt）-OH，立体位阻很大。连续疏水性缬氨酸（Val-Val）的出现，会造成β-折叠的生成；已有大量的实验证明，偶联至第9个氨基酸（K）时，多肽的纯度会急剧下降，胸腺法新是一个典型的“困难序列”多肽（图4）。

图4 胸腺法新的氨基酸序列

自胸腺法新被发现以来，多位研究者采用不同的策略致力于该“困难序列”的合成。最早来自于1980年美国罗氏公司和美国洛克菲勒大学的研究者，他们对主链氨基采用Boc保护的固相合成法，总收率不到7%［37］，后经WANGTW等［38］的改进（采用羟甲基-苯乙酰胺甲基树脂，增强了肽-树脂键的稳定性），纯化收率提高到34%。然而，采用Boc保护基的固相合成法，要频繁用到TFA和HF等腐蚀性气体，污染大，肽树脂不稳定，如今已很少被采用。

为了提高胸腺法新的产率，1985年罗氏公司的FELIX A M等［39］尝试了片段合成法，然而，最后4步的收率仅为30%。1988年德国图宾根大学的ECHNER H等［40］报道了用高效偶联试剂Bop做活化剂，氨基采用Fmoc保护，侧链采用t-Bu或Boc保护的固相合成法，粗品收率达到76%。但经过纯化后，纯品收率比较低。

在这些解决方案中，最成功的莫过于刘标等，他们以HBTU/HOBt/DIPEA体系作为缩合试剂，在易形成α螺旋和β转角的肽序位置，通过采用HOBt/DIC补投的方法促使偶联反应完全。以茚三酮显色的方法对反应进行监控，获得的粗肽纯度为67.2%。以反相液相色谱法为主要分离手段，通过多步分离实现纯化。胸腺法新产品纯度达99.5%以上，总收率为17.2%［41］。另一个成功的解决方案是2009年西班牙生物医学研究所和瑞士Lonza公司合作提出的，他们采用改进的Fmoc/t-Bu的固相合成法，C端的Asp主链羧基用t-Bu保护，侧链羧基连接到PEG氨基树脂上，即采用Fmoc-Asp-OtBu作为第一个引入的保护氨基酸。该方法的粗品纯度达到90%［42］。

3.2 扶素康的合成扶素康是根据HIV膜蛋白gp41的结构设计的新一代膜融合抑制剂，是一个36肽，其序列为：SWETW-EKEIE-NYTKQ-IYKILEESQE-QQDKN-EKDLL-E［43］。然而，由于肽链中含有大量的疏水性氨基酸（W、T、I、L）和立体位阻很大的氨基酸（W、Q、N），以及需要大量的保护基（30个侧链保护基）等造成了其固相合成的困难。扶素康的早期合成采用固相逐步化学合成法。采用Fmoc保护策略、王树脂为固相载体、反应溶剂为DMF、HBTU/HOBt/DIPEA为缩合剂，保护氨基酸2倍过量进行缩合反应、TFA/苯酚/EDT/水为切割条件，得到的粗肽纯度和收率都很低［44］。

为了提高扶素康的产率，郭一琼等［44］采用片段合成的策略。他们以2-氯三苯甲基树脂和王树脂为固相载体，HBTU/HOBt/DIPEA为缩合剂，DMF为反应溶剂，用HOAc（乙酸）/TFE/DCM将全保护多肽片段由树脂上切割下来。将全保护多肽片段依次偶联，再用TFA溶液除去保护基。该条件下合成的扶素康粗品收率达67.31%，按标准曲线定量分析粗品纯度为38.75%［44］。

4 总结和展望

近年来，多肽固相合成技术发展迅速。但由于空间位阻等随机型和β-折叠结构的非随机型“困难序列”的存在，导致缩合反应纯度低、收率低。通过使用混合溶剂、高效率的活化剂和新型树脂等改变反应体系的方法，提高反应温度、调节反应体系的pH值和使用高离盐液等改变反应条件的方法，以及片段缩合、引入取代基等新型合成策略，为实现“困难序列”多肽的合成提供了解决思路。但是，有些策略仍只能处在实验室研究阶段，无法实现大规模生产。

随着多肽应用范围越来越广、研究越来越深入，固相合成多肽在未来依然有巨大的发展优势。随着高效率的活化剂和新型树脂的不断涌现，为解决“困难序列”多肽提供了新的可能。