侵袭性牙周炎与高龋患者唾液微生物对比

王飞虎，陆婧雅

（1.无锡市太湖医院口腔科，无锡 214044；2.无锡市第二人民医院口腔科，无锡 214000）

侵袭性牙周炎是一种常见口腔疾病，其发病率高，持续时间长，对牙周支持组织具有明显破坏效果［1］。龋病是发生于牙体硬组织的的慢性疾病，可导致牙釉质及牙本质瓦解，产生龋洞，甚至致使牙齿脱落［2］。近年来，随着生活水平的提高，口腔疾病的受关注度越来越高，口腔疾病与肿瘤及心血管疾病共同称为人类三大重点防治疾病［3］。定植于人体内的微生物数量远大于自身细胞，而口腔由于潮湿、营养丰富、pH值及温度适宜等原因成为体内最适宜微生物定植繁衍的场所之一［4，5］。定植于口腔的微生物具有相互拮抗或协同作用，同时通过与宿主间的相互作用，影响宿主口腔健康［6］。既往研究证明，侵袭性牙周炎及龋病与口腔微生物息息相关［7，8］。由于侵袭性牙周炎与龋病临床症状及治疗方式不同，临床上常将两种疾病作为完全独立的病态变化［9，10］。为从微生物角度进一步分析口腔疾病发病进程，了解口腔定植微生物的种类对口腔健康的影响，本研究将侵袭性牙周炎与高龋患者的唾液微生物作了对比，现报告如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料选择我院2015年10月～2019年4月确诊并收治的侵袭性牙周炎患者17例及高龋患者15例作为牙周炎组及高龋组。纳入标准：（1）未合并除侵袭性牙周炎及龋病以外的口腔疾病；（2）未合并急慢性感染性疾病；（3）依从性高，能积极配合试验；④纳入试验前24h未行超声洁治。排除标准：（1）年龄＜20岁或＞60岁；（2）妊娠期或哺乳期妇女；（3）近半年内有抗生素使用史；（4）合并严重神经及精神障碍。两组受试者年龄、男女比例等一般资料无明显差异，具有可比性，详见表1。本研究符合赫尔辛基宣言，并获得本院医学伦理委员会批准。所有受试者及家属对本研究内容及流程充分知情并理解，同时自愿给予书面同意。

表1 各组受试者一般资料比较

1.2 方法样本采集：嘱受试者禁食2h，并用无菌蒸馏水漱口1次，动作轻柔。之后由专业牙科医生采用含漱法取每一位受试者的口咽溶解物与唾液的混合液5ml于无菌EP管中。DNA提取与验纯：采用十二烷基硫酸钠法提取样本中DNA。在样本中加入无水乙醇，混匀后静置15min，弃上清，加入适量溶菌酶，混合均匀后置于37℃恒温培养箱中培养20min，以使细菌充分裂解。离心取上清液，加入适量十二烷基硫酸钠混匀于室温下放置5min，动作轻柔避免基因组DNA断裂。再次离心后所得沉淀即为DNA。取部分所得DNA进行琼脂糖凝胶电泳以检测纯度及浓度。整个过程中保证无菌操作，以免污染样本。PCR扩增及纯化：将所得的基因组DNA作为模板，将Bac1与Bac2作为引物，严格按照PCR试剂盒操作说明书，依次经依次经预变性（95℃5min）、变性（93℃1min）、退火复性（55℃1min）、延伸（70℃1.5min）对基因组DNA进行扩增。为增加扩增产物量，重复预变性到延伸过程40次。引物序列：Bac1：5，-CGCCGCGGCGCCCGT CGGCTCCCGACTCGTGAAGCCGCATGCCGTAGCC3，；Bac2：5，-GCAGTACCGCGATTCTAGCTCG-3，。采用2%的琼脂糖凝胶对PCR扩增产物电泳25min验证扩增产物纯度，采用紫外分光光度仪（深圳市绿生态科技有限公司，型号：KPY-V-5100）鉴别合格扩增产物。将所得合格扩增产物进行变性梯度凝胶电泳，根据所得电泳图谱，采用非加权类平均法对受试者唾液微生物进行聚类分析。

1.3 观察指标各组受试者唾液微生物DNA扩增情况，变性梯度凝胶电泳图谱特征，条带数量，戴斯相似性系数，微生物聚类分析结果。

1.4 统计学处理本研究数据分析由SPSS 20.0数据软件完成，其中组间计量资料采用独立样本t检验分析，计数资料采用χ2检验，聚类方法采用系统聚类法，其中相似性特征度量采用夹角余弦法。当P＜0.05时，提示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 PCR扩增情况将两组受试者唾液微生物分别扩增，经凝胶电泳及紫外分光光度仪检验纯度及完整度后，分别从侵袭性牙周炎组及高龋组各挑选出12个合格样本进行后续研究。将24个样本分别编号为AgP 1-12，SC13-24，紫外分光光度仪检测结果详见表2。

表2 各合格样本紫外分光光度仪检测结果

2.2 各组受试者唾液微生物变性梯度凝胶电泳图谱特征每位受试者唾液微生物变性梯度凝胶电泳图未出现完全相同的泳道，同一疾病组不同个体的唾液微生物变性梯度凝胶电泳图存在共有条带，详见图1。

图1 各组受试者唾液微生物变性梯度凝胶电泳图谱

2.3 各组受试者唾液微生物变性梯度凝胶电泳图谱条带数量比较侵袭性牙周炎组受试者变性梯度凝胶电泳图谱平均条带有（11.27±1.54）条，高龋组受试者变性梯度凝胶电泳图谱平均条带有（12.03±1.49）条，两组受试者变性梯度凝胶电泳图谱平均条带无明显差别，比较差异无统计学意义（P＞0.05），详见表3。

表3 各组受试者唾液微生物变性梯度凝胶电泳图谱条带数量比较

2.4 各组受试者唾液微生物戴斯相似性系数比较侵袭性牙周炎组受试者唾液微生物组内戴斯相似性系数平均为（58.37±9.73）%；高龋组受试者唾液微生物组内戴斯相似性系数平均为（56.16±9.51）%；侵袭性牙周炎组受试者于高龋组受试者唾液微生物组内戴斯相似性系数平均为（21.83±3.69）%。两组患者组间戴斯相似性系数明显低于侵袭性牙周炎组及高龋组患者各自组内戴斯相似性系数，比较差异具有统计学意义（P＜0.05）。

2.5 各组受试者唾液微生物聚类分析结果比较侵袭性牙周炎组及高龋组受试者唾液微生物各自形成的聚类群具有明显区别（P＜0.05），详见图3。

图3 各样本唾液微生物聚类分析

3 讨论

多种微生物的共同作用对口腔健康有重要意义，近年来口腔微生物研究逐渐受到科研人员的重视。侵袭性牙周炎及龋病是由微生物引起的最常见的口腔疾病之一，刘树泰［11］等在其研究报告中指出，龈下菌斑是侵袭性牙周炎的主要病因。R Puttipan［12］等研究发现细菌感染对龋病的发展有重要作用。侵袭性牙周炎及龋病分别破坏牙周支持组织及牙体硬组织，严重危害患者健康及生活质量，故而探究口腔微生物对侵袭性牙周炎及龋病的影响具有重要意义［13，14］。16S rDNA是一种广泛存在于各种细菌的基因，由保守区及高变区两部分结构组成［15］。不同细菌16S rDNA可变区具有各自特性，故而其可用于细菌种类的辨别鉴定［16］。本研究使用16S rDNA引物Bac1及Bac2对唾液中提取的DNA进行PCR扩增，并通过变性梯度凝胶电泳对微生物群落构成进行分析。

变性梯度凝胶电泳是用于分析细菌多样性的常用手段之一，具有提供群落优势信息、多个样本同时操作及可重复性等优点［17］。研究者可通过所得图谱上条带的序列及数量分析鉴定样本中细菌的群落构成，其中条带数量代表菌群数量，而形态可用于辨别菌群种类［18］。但变性梯度凝胶电泳只是一种定性研究，而不能对唾液中微生物水平高低作出判断［19］。戴斯相似性指数常在微生物分析中用于衡量样本间的相似程度，戴斯相似性指数越高，说明两组样本微生物种类相同部分越多［20］。聚类分析是将研究对象分为具有相同特质群组的一种统计学方法［21］。生物学上常使用聚类分析法对基因进行分类，以此获得对种群固有结构的认知［22］。

本研究结果显示，每位受试者唾液微生物变性梯度凝胶电泳图未出现完全相同的泳道，提示患有相同口腔疾病的患者唾液微生物种类存在个体差异性，但同一疾病组不同个体的唾液微生物变性梯度凝胶电泳图存在共有条带，提示患有同种口腔疾病的患者唾液中存在相同微生物。侵袭性牙周炎组受试者变性梯度凝胶电泳图谱平均条带有（11.27±1.54）条，高龋组受试者变性梯度凝胶电泳图谱平均条带有（12.03±1.49）条，两组受试者变性梯度凝胶电泳图谱平均条带无明显差别，说明侵袭性牙周炎及高龋患者唾液中微生物在群落数量上无明显差别。本研究结果还显示，任意两组样本间的相似系数均低于100%，且侵袭性牙周炎组与高龋组患者组间戴斯相似性系数明显低于侵袭性牙周炎组及高龋组患者各自组内戴斯相似性系数，提示任意样本间菌群种类及数量均存在差异，且不同口腔疾病间唾液微生物差异较同一疾病明显。聚类分析结果显示，侵袭性牙周炎组及高龋组受试者唾液微生物各自形成的聚类群具有明显区别，进一步说明了侵袭性牙周炎与高龋患者唾液微生物存在明显区别。

综上所述，侵袭性牙周炎患者与高龋患者唾液微生物群落构成具有明显差异，不同微生物的定植对口腔疾病具有重要影响。但由于变性梯度凝胶电泳只是一种定性研究，而不能对唾液中微生物水平高低作出判断，故需之后结合培养法进一步分析侵袭性牙周炎及高龋患者唾液中各微生物水平。