基于网络药理学探讨宣白承气汤治疗新型冠状病毒肺炎的作用机制

豆文文，宋桂华，张岩，孙萌萌，张冰雪…，赵郑琦

（1.河南中医药大学第一临床医学院，河南 郑州 450000；2.河南中医药大学第一附属医院，河南 郑州 450000）

0 引言

新型冠状病毒肺炎（Corona Virus Disease 2019，COVID-19）简称新冠肺炎，是由新型冠状病毒（SARS-CoV-2）引起的急性感染性疾病，临床主要表现为发热、乏力、干咳等症状，严重者可快速进展为急性呼吸窘迫综合征、脓毒症、休克等[1]，因其传染性强、人群普遍易感等特点，给社会和家庭带来沉重的负担。目前本病治疗以广谱抗病毒和对症支持治疗为主，尚缺乏特异性药物[2]，在此背景下，中医方案的制定与实施在疫情防治中发挥了积极作用，其缩短病程、防止病情恶化、促进肺炎康复等优势逐渐被重视[3]。

宣白承气汤出自《温病条辨》，为吴鞠通所创八大承气新方之一，由生石膏、生大黄、瓜蒌皮、杏仁4味药物组成，具有宣肺通腑功效，是新冠肺炎常用方剂之一[4-5]，但由于中药复方多成分、多靶点、多途径及靶点之间相互作用的特点，使宣白承气汤对COVID-19作用机制缺乏系统性及整体性研究，网络药理学的发展为此提供了契机。

网络药理学的概念由Andrew L Hopkins于2007年首次在Nature Biotechnology上撰文明确[6]，随后将网络药理学作为“下一代药物研发模式”进行阐述[7]，该研究策略的整体性、系统性特点与中医学从整体的角度去诊治疾病的理论，中药及其方剂的多成分、多途径、多靶点协同作用的原理殊途同归[8]，因而迅速被应用于寻找中药作用靶点、相关疾病药理机制等相关领域的研究中。本研究通过网络药理学方法筛选宣白承气汤的主要活性成分并以此为研究对象，探讨其治疗COVID-19的作用机制，为后续临床及实验提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 宣白承气汤化学成分的收集及筛选

基于中药系统药理学数据库和分析平台[9]（TCMSP，http://tcmspw.com/tcmsp.ph）检索杏仁、大黄的化学成分，筛选同时满足ADME参数口服生物利用度（OB≧30%）和类药性（DL≧0.18）的化学成分；通过中药综合数据库[10]（TCMID，http://www.megabionet.org/tcmid/）获取石膏和瓜蒌皮的化学成分，保存化学成分的Canonical SMILES结构，对于数据库无法提供SMILES结构的成分，通过ALOGPS2.1（http://www.vcclab.org/lab/alogps/）计算获得，建立宣白承气汤主要有效成分数据库。

1.2 主要有效成分靶点预测

Swiss Target Prediction数 据 库（http://www.swiss target prediction.ch/）基于已知配体的2D和3D相似性度量的组合来预测生物活性分子目标[11]，本研究通过该数据对瓜蒌皮、苦杏仁、大黄3味药物的主要化学成分进行靶点预测，条件限定为 Homo sapiens，选取Probability>0的靶标结果，石膏的化学成分靶点通过DRAR-CPI数据库（https://cpi.bio-x.cn/drar/）预测获取，筛选Z-score<-0.5的靶标。由于检索到的成分靶点存在命名不规范的情况，故将筛选所得靶点统一在Uniprot数据库（http://www.uniprot.org/）进行校正和转化，并以Swiss-Prot ID表示，去除重复项，建立宣白承气汤4味中药的靶点数据库。

1.3 疾病靶点的获得

以“novel coronavirus pneumonia”为 检 索 词，从 Gene Cards数 据 库（https://www.genecards.org/） 及 OMIM 数 据库（https://www.omim.org/）获得新冠肺炎疾病的相关靶点，通过UniProt数据库将疾病靶点Gene name校正为官方名称，即Swiss-Prot ID，重复靶点仅保留1个，与1.2所得药物预测靶点进行映射，通过在线软件绘制韦恩图（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/），即得到宣白承气汤治疗新冠肺炎的预测靶点。

1.4 蛋白-蛋白相互作用网络的构建及关键靶点筛选

将宣白承气汤治疗新冠肺炎的预测靶点导入STRING数据库（https://string-db.org/），限定物种为 Homo sapiens，获得蛋白相互作用数据TSV格式文件，导入Cytoscape3.2.1软件绘制蛋白-蛋白相互作用网络，并通过其Network Analysis功能计算拓扑参数，根据Degree值调整节点大小和颜色，筛选关键靶点。

1.5 生物过程与通路富集分析

为获得宣白承气汤治疗新冠肺炎核心靶点的基因功能和主要作用通路，将共有靶点导入Cytoscape3.2.1的Clue GO插件进行基因本体论（gene ontology，GO）分析和KEGG通路富集分析，设置P≦0.01，获取显著性较高的生物过程和通路富集结果。

2 结果

2.1 宣白承气汤活性成分筛选及靶点预测结果

TCMSP和TCMID数据库共收录宣白承气汤化学成分215个，符合筛选条件的共有45个，其中苦杏仁19个、大黄16个、瓜蒌皮9个、石膏1个，将主要化学成分Canonical SMILES结构上传至Swiss Target Prediction及DRAR-CPI数据库进行靶点预测，并根据P值及Z-score值筛选、重复靶点保留1个，共得到预测靶点704个，主要化学成分及靶点数目见表1。

表1 宣白承气汤中主要化学成分及靶点数目

2.2 宣白承气汤治疗新冠肺炎的预测靶点

通过GeneCards及OMIM数据库分别获得新冠肺炎相关靶点259个、90个，取交集去重后获得新冠肺炎相关靶点333个，与2.1所得的704个预测靶点进行映射，获得66个交集靶点，即宣白承气汤治疗新冠肺炎的可能靶点，见图1。

图1 药物靶点与疾病靶点韦恩图

2.3 蛋白相互作用网络的构建及关键靶点筛选

将交集靶点通过STRING数据库和Cytoscape3.2.1软件绘制蛋白相互作用网络及拓扑结构分析，共65个节点，平均Degree值18.369，见图2，图中节点表示靶蛋白，边表示相互作用，节点的颜色和大小表示Degree值的大小，颜色由绿色到红色、节点由小到大表示Degree值逐渐增大，可得到蛋白结合较高的靶点如白介素6（IL6）、表皮生长因子受体（EGFR）、半胱氨酸蛋白酶3（CASP3）、丝裂原活化蛋白激酶1（MAPK1）、白介素4（IL4）等。宣白承气汤治疗新冠肺炎的66个靶蛋白中，65个靶蛋白与其他蛋白具有相互作用，与中药复方靶点之间相互作用的特点相符。

图2 宣白承气汤蛋白PPI网络

2.4 生物过程和通路分析

将宣白承气汤与新冠肺炎共有靶点导入Cytoscape3.2.1的Clue GO插件，并根据P≤0.01筛选，获得相关生物通路41条，主要涉及运动的正调节（positive regulation of locomotion）、活 性 氧 代 谢 过 程（reactive oxygen species metabolic process）、脂质修饰（lipid modification）、细胞对氧化应激的反应（cellular response to oxidative stress）等，见图3。KEGG通路富集涉及糖尿病并发症AGE-RAGE信号通路（AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications）、癌症通路（Pathways in cancer）、原发性免疫缺陷（Primary immunodeficiency）、核 因 子 -κB信 号 通 路（NF-kappa B signaling pathway）等信号通路，见图4。

图3 宣白承气汤治疗新冠肺炎的GO生物过程

图4 宣白承气汤治疗新冠肺炎的KEGG信号通路

3 讨论

新冠肺炎属于中医学“疫”病范畴，疫毒犯肺，气失宣降，肺津不布则痰涎壅滞，痰壅气逆则喘促不宁，肺与大肠相表里，脏病及腑，阳明热结则见大便秘结等症状。阳明腑实形成，疫邪有所依附，久恋不去，瘀闭肺络及心包，从而出现呼吸困难、咯血等危急重症，故治疗上应宣肺通腑泻热，肺肠合治[12]。宣白承气汤是中医“肺与大肠相表里”脏腑相关理论指导下“肺肠同治”的代表方剂之一[13]，方中石膏清泄肺热，瓜蒌皮、杏仁既可宣降肺气，又可通过宣降肺气助腑气通调，治上即可治下，大黄虽重在邪热通便，亦可通过泻下助肺气下行，四药合用，上宣肺气，下通地道，脏腑并调，在新冠肺炎的治疗中发挥重要作用，但其效应机制尚不清楚，本研究通过网络药理学技术，依托生物信息学及多个数据库初步探讨宣白承气汤治疗新冠肺炎的主要活性成分、作用靶点及关键通路。

本研究经筛选获取宣白承气汤主要有效成分45个，可能是宣白承气汤治疗新冠肺炎的活性成分。新型冠状病毒肺炎诊疗方案第七版中指出COVID-19患者可根据病情选择抗病毒、抗菌、免疫支持等治疗方案，抗艾滋病药物洛匹那韦/利托那韦可用于COVID-19的治疗,天花粉蛋白（trichosanthin）具有抗病毒、免疫调节等作用，赵巧云等[14]将人类免疫缺陷病毒1型在细胞系中培养, 加入天花粉蛋白后观察细胞病变情况，发现天花粉蛋白在培养细胞系中可有效抑制人类免疫缺陷病毒1型。芦荟大黄素、大黄素（Rhein）均具有抑菌、抗炎、免疫调节等多种药理作用[15,16]，祁红[17]通过动物实验证实大黄素起效快,对炎症早期的渗出、毛细血管通透性增高、白细胞游走等有较好的对抗作用, 对急性炎症有明显对抗作用。新冠肺炎部分患者在疾病发展过程中因炎症风暴的发生而出现免疫紊乱，研究发现[18]，新冠肺炎患者血清中IL-2、IL-6、TNF-α等多种细胞因子水平升高，芦荟大黄素可通过抑制IL-2诱发的T细胞增殖发挥免疫调节作用[19]，亦可降低血清中PAF、IL-6和TNF-α水平发挥抗炎作用[20]。β-谷甾醇（beta-sitosterol）和豆甾醇（Stigmasterol）均具有抗炎活性，β-谷甾醇可通过减少NO的合成，抑制巨噬细胞IL- 6活性，减少IL-1、TNF-α等炎性因子的分泌发挥抗炎作用[21]，豆甾醇能明显抑制LPS诱导的环氧合酶-2、诱导型一氧化氮合酶（iNOS）mRNA和蛋白水平的提高，抑制前列腺素E2（PGE2）和一氧化氮(NO)的释放发挥抗炎作用[22]。综上，宣白承气汤中有效成分可能通过抗病毒、抗炎、抗菌、免疫调节等途径发挥治疗新冠肺炎的作用。

宣白承气汤治疗新冠肺炎的靶点共66个，通过STRING数据库我们获得蛋白结合度较高的靶点如IL-6、EGFR、CASP3、MAPK1、MAPK3、MAPK8。急性呼吸窘迫综合征（ARDS）是新冠肺炎病情进展的严重并发症之一，ARDS死亡组患者血清中IL-6水平显著升高[23-24]，故推测IL-6参与ARDS的发病过程，有研究表明[25]，在西医常规治疗基础上配合宣白承气汤有助于改善患者的呼吸功能和呼吸力学参数，其机制可能与减轻全身炎症反应有关。此外，尚俊等[26]研究发现宣白承气汤佐治ALI/ARDS的疗效优于单纯西医治疗，可有效降低患者血清中CRP、IL-6、TNF-α和内毒素水平的水平。表皮生长因子受体（EGFR）是一种酪氨酸激酶受体，研究发现抑制EGFR活化能降低病毒的感染滴度[27]。Caspases 作为一类蛋白裂解酶，可被许多促凋亡因子（如细菌病毒感染、发热或氧自由基等）所活化，半胱氨酸蛋白酶-3（CASP3）为最主要的凋亡调节因子[28]，炎性介质阻断剂可有效抑制CASP3的表达，减少凋亡细胞数量[29]。MAPK1、MAPK3、MAPK8为丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）家族成员，活化的MAPK可通过磷酸化核转录因子、细胞骨架蛋白及酶类等参与细胞增殖、分化、转化及凋亡的调节，并与炎症、肿瘤等多种疾病的发生密切相关[30]。

生物过程GO分析和KEGG信号通路分析结果显示，宣白承气汤可能通过多通路发挥治疗新冠肺炎的作用。活性氧代谢过程为富集程度较高的生物过程之一，活性氧在肺损伤中一方面可促进黏蛋白的分泌，另一方面可起到炎症反馈放大环和损伤血管内皮作用[31]，研究证实在急性肺损伤中肺内大量聚集在中性粒细胞，肺泡巨噬细胞内NF-κB被激活，采用抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸、谷胱甘肽等可抑制NF-κB的活化，同时也明显改善肺部炎性损伤程度[32]。此外，NF-κB参与介导免疫应答、病毒复制等过程，在调节炎症反应相关基因中起关键作用，研究发现[33]，重症肺炎的病理生理学涉及复杂的细胞因子和炎症介质网络，NF-κB是导致网络激活、促进重症肺炎发展的中枢，通过阻断NF-κB途径可改善其异常的病理生理及预后。

综上，本研究基于网络药理学技术对宣白承气汤治疗新型冠状病毒肺炎的活性成分、靶点及作用机制进行了初步探讨，但由于该研究数据均来源于已有的数据库资源，且缺乏实验支持，后期可通过动物实验及实验室检测进一步探索与验证。