Kir4.1 对少突胶质前体细胞分化的影响

柴 智 ， 肖晶晶 ， 彭 涛 ， 王丽娟 ， 毕逢辰 ， 王俊燕 ，海霞霞 ， 丁万聪 ， 李云鸿 ， 王 银

（1.宁夏颅脑疾病重点实验室，银川 750004； 2.宁夏医科大学基础医学院，银川 750004）

少突胶质细胞（oligodendrocyte，OL）是神经元髓鞘的形成细胞，在中枢神经系统（central nervous system，CNS）中发挥着重要的作用。如神经信号的传递与髓鞘的形成[1-2]。OL 由特异性表达NG2 硫酸软骨素蛋白多糖和血小板源性生长因子 α 受体（α-receptor for platelet-derived growth factor，PDGFRα）的少突胶质前体细胞（oligodendrocyte precursor cell，OPC）分化而来。在 OPC 发育的过程中，其经过长距离迁徙至大脑各个区域的轴突附近并且进行大量增殖，分化成为OL，最终形成髓鞘[3]。

体外培养OPC 重建其分化发育过程的研究[4]，以及OPC 髓鞘化与分化机制的研究目前比较普遍[5-7]。OL 系特有的 OL 转录因子 2（Olig2）是一种促分化转录因子，敲除小鼠的Olig2 会引起OL 谱系缺失和严重的髓鞘发育障碍[8]。对于现有的OPC 分化的研究来说，其主要还是集中于转录因子，而关于OPC 细胞膜上的离子通道作用的研究还是微乎其微。内向整流钾离子通道4.1（inwardly rectifying K channel 4.1，Kir4.1）是细胞膜上的蛋白复合体，对维持细胞内外K+稳态有着重要作用。有报道[9]称，在多发性硬化症患者的病灶区可以检测到Kir4.1 特异性抗体的表达。Kir4.1对神经生理活动的正常进行非常重要[10]，尤其对维持正常的神经功能、电解质的平衡及调节神经的兴奋性具有极其重要的作用，但在OPC 的分化中是否发挥作用还未可知。

本研究通过体外培养 OPC 与 OL，利用Western blot 分别检测 OPC 与 OL 中 Kir4.1 的蛋白表达水平，通过qRT-PCR 检测OPC 和OL 中Kir4.1的mRNA 表达情况。此外OPC 中加入Kir4.1的特异性阻断剂地昔帕明（desipramine，Des）后检测髓鞘碱性蛋白（MBP）和Olig2 的表达，探讨Kir4.1 对OPC 分化的影响。

1 材料与方法

1.1 实验材料

SD 大鼠购自宁夏医科大学实验动物中心；三碘甲状腺原氨酸（T3）购自 Sigma 公司；KGP250 全蛋白提取试剂盒购自广东泛思生物科技有限公司；蛋白定量BCA 试剂盒购自Pierce 公司；DMEM培养基购自Hyclone 公司；胎牛血清购自Gibco公司；Des 购自 Tocris 公司；SDS-PAGE 凝胶制备试剂盒CW0022 购自凯基生物公司；ECL 化学发光底物试剂盒NCI5079 购自凯基生物公司；HRP标记 Mouse 二抗、HRP 标记 Rabbit 二抗均购自Pierce 公司；Kir4.1、MBP、GAPDH 和 Olig2 抗体均购自Millipore 公司；DAPI 染液购自碧云天公司；SYBR Green 试剂盒购自Thermo Fisher scientific公司；HRP 标记的红色荧光二抗、HRP 标记的绿色荧光二抗均购自中杉金桥公司。

1.2 OPC 和OL 细胞的培养与收集

取刚出生SD 大鼠的大脑皮质，用镊子夹碎，用胰酶消化20 min，HBSS 洗3 遍后培养于培养瓶中；培养一周后，以250 r·min-1的转速在摇床上摇细胞16 h，除去其中的星形胶质细胞和小胶质细胞，将上清离心，得到的沉淀便是OPC。OL 由OPC 加入 T3 诱导获得，OPC 细胞培养于 DMEM 培养基中，其中加入20%的胎牛血清与1%双抗。

1.3 qRT-PCR 检测 OPC 和 OL 细胞中 Kir4.1 mRNA 表达水平

分别取1.2 方法制备的OPC 与OL 细胞，加入Trizol 裂解液，待其充分裂解之后再提取细胞总RNA，再加入引物和酶，使其反转录形成cDNA，使用SYBR Green 试剂盒配制荧光定量PCR体系，置Light Cycler480 PCR 仪中扩增。Kir4.1上游引物序列5’-TGA TGT ATC TCG ATT GCT GC-3’，Kir4.1 下游引物序列 5’-CCC TAC TCA ATG CTC TTA AC-3’，GAPDH 上游引物序列 5’-TGT TAC CAA CTG GGA CGA CA-3’，GAPDH 下游引物序列5’-AAG GAA GGC TGG AAA AGA GC-3’。反应条件为：95 ℃预变性 5 min，95 ℃ 15 s，65 ℃30 s，72 ℃ 30 s，进行 40 个循环。荧光定量 PCR读取目的基因C（tcycle threshold）值，采用2-△△Ct法计算相对表达量。最后进行琼脂糖凝胶电泳，将实验结果在凝胶紫外分析仪上进行可视化分析。

1.4 Western blot 检测 OPC 和 OL 细胞中 Kir4.1蛋白表达

分别取1.2 方法制备的OPC 与OL 细胞，用全蛋白提取试剂盒提取细胞总蛋白，BCA 试剂盒蛋白定量，上样量为30 μg。取等量的蛋白进行SDSPAGE 电泳，分离后将蛋白转移至PVDF 膜上，将PVDF 膜放入含5%的脱脂奶粉的磷酸盐吐温缓冲液（PBST）中封闭1 h。待奶粉封闭结束之后，按照待测分子质量的大小，分别加入相对应的稀释后的一抗（Kir4.1 为 1∶2000），4 ℃摇床孵育过夜。待PBST 洗涤充分之后，加入1∶10000 稀释后的二抗，常温摇床振荡1 h，最后上机显影，内参为GAPDH。另将OPC 分为用DMEM 培养的对照组，用含Kir4.1阻断剂 Des 2 mmol·L-1的 DMEM 培养的 Des 处理组，每24 h 换液，培养至96 h，收集细胞，同上Western blot 操作，检测两组细胞中MBP 表达。MBP一抗为 1∶5000 稀释，其余同上。

1.5 免疫荧光细胞染色法检测OPC 中Olig2 和MBP 的含量

实验分为对照组和Des 处理组。将OPC 接种于6 孔板中并放入盖玻片。细胞爬片后，分别用DMEM 培养基（对照组）、含 2 mmol Des 的 DMEM培养基（Des 处理组）处理OPC 细胞96 h。用4%多聚甲醛室温固定30 min，再用磷酸盐缓冲液（PBS缓冲液）漂洗3次。用0.2%Triton X-100 透化10 min后，加入 PBS 稀释后的一抗（MBP 为 1∶5000；Olig2为 1∶1000），4 ℃过夜。PBS 冲洗 3 次。加入 1∶1000 稀释后的荧光二抗，37 ℃静置 1 h。PBS 再次洗涤3 次，最后用DAPI 封片，于荧光显微镜下观察对照组和Des 处理组荧光标记的MBP 和Olig2 细胞数目变化。在荧光显微镜下取各组同一视野内 MBP 和Olig2 阳性细胞的照片（100 倍）分别导入Leica Qwin系统进行图像分析。随机选取3 个Merge 共染视野中OL 细胞所占比率作为该组的统计数值。

1.6 统计学方法

使用Image J 软件处理Western blot 检测结果，qRT-PCR 与免疫荧光染色的数据，使用GraPhpad Prism7 作图。计量资料用均数±标准差（）表示，组间比较采用t检验。P≤0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 qRT-PCR 检测 OPC 与 OL 中 Kir4.1 mRNA表达结果

qRT-PCR 结果显示，Kir4.1基因在 OL 和OPC 中均有表达，OL 组中Kir4.1mRNA 的表达水平高于 OPC 组（P<0.01），见图 1。

图1 qRT-PCR 检测 OPC 与 OL 中 Kir4.1 mRNA 表达结果

2.2 Western blot 检测 OPC 与 OL 中 Kir4.1 蛋白表达结果

Western blot 结果表明，Kir4.1 在 OL 和 OPC中均有表达，OL 组中Kir4.1 的蛋白表达水平高于 OPC 组（P<0.01），见图 2。

图2 Western blot 检测 OPC 与 OL 中 Kir4.1 蛋白表达结果

2.3 Western blot 检测 Des 对 OPC 分化的影响

Western blot 结果显示，在体外，Des 抑制Kir4.1后加入成熟OL 的标记物MBP 蛋白的表达比对照组降低（P<0.01），见图 3。

图3 Western blot 检测Des 对OPC 分化的影响

2.4 免疫荧光细胞染色法检测Des 对OPC 分化的影响

免疫荧光化学染色检测MBP（红色）与Olig2（绿色）的表达，MBP 为成熟OL 的标记物，Olig2为OPC 的标记物，用来标记总细胞数目，二者共染即为OL。免疫荧光染色结果显示，Des 处理组MBP 表达量比对照组少（P<0.01），见图 4。

图4 免疫荧光染色法检测Des 对OPC 分化的影响

3 讨论

近年来，CNS 脱髓鞘相关疾病患者人数的不断增多引起了人们的广泛关注，因此，阐明其发病机制，寻找潜在的治疗靶点，将有望为未来的临床治疗提供新的理论基础。

OPC 分化发育成为OL 细胞，随后OL 进一步分化发育形成髓鞘[11]。因此，CNS 髓鞘形成的前提条件是OPC 向OL 细胞的正常分化发育。Kir4.1 分布广泛，主要分布在脑干、海马、大脑皮质、丘脑等组织中。Neusch 等[12]研究发现，敲除Kir4.1 的小鼠会表现出癫痫和全身震颤，最终导致死亡；之后有研究报道[13]，敲除Kir4.1 的小鼠会引发脑内轴突的退化和脱髓鞘的病理改变，这为Kir4.1 参与OL 的发育提供了新的证据。Zhang等[14-15]研究发现新生鼠发育早期OPC 上Kcnj10基因表达升高，Kcnj10为Kir4.1 通道基因。另有研究[16]发现，OL 中Kir4.1 的免疫活性在多发硬化症中有不同程度的降低。当前，对于OPC 分化形成OL 的具体机制仍不十分清楚，Kir4.1 对OPC 的分化有何影响仍未明确。因此，本研究主要探究Kir4.1 对OPC 分化的影响。

本研究结果显示，OL 组中Kir4.1 的mRNA与蛋白质表达水平均高于OPC 组。说明在OPC的体外分化过程中，Kir4.1 发挥了积极的作用。此外，在加入Kir4.1 特异性阻断剂Des 后，OL 细胞数量减少，说明在阻断Kir4.1 条件下，OPC 的体外分化受到了抑制。因此，Kir4.1 在OPC 的分化过程中是不可或缺的，在体外阻断Kir4.1 可以抑制OPC 的分化。

CNS 髓鞘相关疾病的形成过程是极其复杂的，受诸多因素影响，但主要表现为OPC 不能正常发育为OL，导致髓鞘形成失败[17]。其发病机制涉及机体多个部位，通过研究可以提出一个可能，内向整流钾离子通道Kir4.1 受到了异常阻断，影响了OPC 的正常分化，但在体内是否导致同样的OPC 分化受阻，需要后续进一步的研究，本研究为CNS 髓鞘相关疾病的发病机制的研究提供了新的方向，为临床髓鞘修复的靶点提供了细胞实验依据。