多参数流式细胞术对多发性骨髓瘤患者的诊断和预后预测价值

王洪建，刘燕飞，李智全，纪国超，武欣，李志春

濮阳市人民医院检验科，河南 濮阳 457000

多发性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）作为血液系统常见恶性肿瘤之一，多于中老年人群高发，疾病早期缺乏特异性表现，随着中国老龄化人口增多，医疗水平的提升，其在中国发病率呈上升趋势。MM 通过单克隆浆细胞增殖间分泌出的大量单克隆免疫球蛋白，抑制正常多克隆浆细胞和免疫球蛋白分泌，由于单克隆浆细胞具有无限增生、广泛浸润的特性，导致机体出现各种不良反应。MM 主要临床特征为出现骨髓瘤细胞，且各患者细胞数不尽相同，其细胞数高低不仅与血清单克隆免疫球蛋白的水平、骨质破坏程度、尿中轻链含量、血清钙值等有关，同时还与疾病的不良反应、患者预后密切相关。近年来，随着多色流式技术的不断发展，多参数流式细胞术在MM 诊断中的应用日益广泛，该技术可通过不同抗体间混合，快速测量单个相关生物学特点，从而对MM 进行量化评估，但对其预后研究相对较少。基于此，本研究对MM 患者使用多参数流式细胞术检测，分析其预后预测价值，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集2014年10月至2017年10月于濮阳市人民医院治疗的MM 患者病历资料。纳入标准：①符合《血液病诊断及疗效标准（第三版）》中MM的诊断标准；②初诊患者，实施多参数流式细胞术检查，疾病确诊时间在检查结束后2周内；③多参数流式细胞术检查前未实施有创检查，且未实施任何放化疗方案治疗；④具有完整的临床资料、病理资料及随访资料，能正常获取研究所需全部信息；⑤经多参数流式细胞术检查后至少接受过1次化疗。排除标准：①心肺基础功能相对较差，无法耐受化疗，未完成1个完整的化疗周期；②出现髓外病变；③未接受治疗或拒绝接受治疗；④合并其他严重疾病，如重要脏器（心、肺、肝、肾等）功能不全、恶性肿瘤、脑梗死等。根据纳入、排除标准，共纳入86例MM患者作为观察组，其中男46 例，女40 例；年龄50～75 岁，平均（62.38±7.12）岁；M蛋白类型：免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）G型40例（46.51%），IgA型22例（25.58%），IgD型8 例（9.30%），轻链型16 例（18.60%）；诊断时临床分期：Ⅰ期7 例（8.14%），Ⅱ期16 例（18.60%），Ⅲ期63例（73.26%）；治疗方案：13例（15.12%）使用马法兰+强的松（MP）方案，1～3 个疗程；25 例（29.07%）使用环磷酰胺+长春新碱+卡氮芥+马法兰+强的松（M2）方案，1～4 个疗程；48 例（55.81%）使用长春新碱+多柔比星+地塞米松±沙利度胺（VAD±T）方案，1～3 个疗程。另选取同期健康体检过程中自愿接受多参数流式细胞术检查的健康体检者40例作为对照组，其中男25 例，女15 例；年龄50～75 岁，平均（63.76±7.55）岁。两组患者性别、年龄比较，差异均无统计学意义（

P

﹥0.05），具有可比性。

1.2 检测方法

两组患者均使用Navios三激光十色流式细胞仪（购自Beckman-Coluter公司）进行免疫表型检查，其中鼠抗人单克隆抗体分别为CD45、CD19、CD117、CD56、CD138、CD38，检查方式：无菌下抽取受试人群2 ml骨髓液，加入肝素抗凝，再将200 μl骨髓单细胞悬液加入2 ml 氯化铵溶血15 min，生理盐水洗两遍。取干粉多色抗体管，加入溶血标本处理液，混匀避光15 min，生理盐水洗一次，再加固定液100 μl，混匀避光15 min，洗一次后加穿孔剂100 μl，充分吹打细胞混匀，加入cKappa/cLamda 液1 μl，混匀避光30 min，完成后上机检测。cKappa与cLamda结果判定：cKappa 与cLamda 双阳为正常多克隆浆细胞；cKappa与cLamda单阳为异常克隆性细胞；如果cKappa 与cLamda 中一个阳性而另一个弱阳性且两者比例大于3∶1也判定为异常克隆浆细胞。

观察组患者入院后进行常规对症支持治疗，再进行流式细胞仪检查，待患者生命体征平稳后实施化疗，实施为期2 年随访（截至2019 年10 月），主要随访形式有门诊随访、家访、电话随访等，并填写相关随访记录。

1.3 观察指标

观察两组受试人群多参数流式细胞术的免疫表型（CD19、CD117、CD56、CD138、CD38）克隆浆细胞表达情况。收集观察组患者2 年随访资料，观察其总生存率，即初始治疗时间至死亡或末次随访截止日期，对比不同免疫表型阳性和阴性患者的总生存率。参照相关文献[6-7]，以CD45/SS 设门，分别为CD38（+）/CD138（+）/CD19（-）、CD38（+）/CD138（+）/CD19（-）/CD56（+）、CD38（+）/CD138（+）/CD19（-）/CD117（+），每组均确定cKappa/cLamda 抗体组合为异常单克隆后进行结果分析。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 浆细胞免疫表型阳性率的比较

两组受试者CD138 阳性率比较，差异无统计学意义（

P

﹥0.05）；观察组患者CD19 阳性率明显低于对照组，CD117、CD56、CD38 阳性率均明显高于对照组，差异均有统计学意义（

P

﹤0.01）。（表1）

表1 两组受试者浆细胞免疫表型阳性情况的比较[n（%）]

2.2 总体生存情况

观察组86 例MM 患者1、2 年总生存率分别为83.72%（72/86）、69.77%（60/86）。

2.3 浆细胞不同免疫表型阳性和阴性MM 患者2年总生存率的比较

Kaplan-Meier 法生存分析结果显示：CD19、CD117、CD138、CD38 免疫表型阳性和阴性MM 患者的2 年总生存率比较，差异均无统计学意义（

P

﹥0.05）；CD56 免疫表型阳性MM 患者的2 年总生存率明显高于阴性MM 患者，差异有统计学意义（

P

﹤0.01）。（表2）

表2 不同免疫表型阳性和阴性MM 患者2 年总生存情况的比较（n=86）

2.4 不同免疫表型预测MM 预后的ROC 曲线分析

ROC 曲 线 分 析 结 果 显 示，CD19、CD117、CD138、CD38 免疫表型对MM 患者的预后预测价值有限（AUC﹤0.6），CD56 免疫表型对MM 患者有一定的预后预测价值（AUC﹥0.6）。（表3、图1）

图1 不同免疫表型预测MM预后的ROC曲线

表3 不同免疫表型对MM 的预后预测价值

2.5 不同组合预测MM 预后的ROC 曲线分析

CD38（+）/CD138（+）/CD19（-）对MM 患者预后 预 测 价 值 明 显 高 于CD19、CD117、CD56、CD138、CD38，差异均有统计学意义（

Z

=5.212、2.802、3.038、3.223、3.303，

P

﹤0.01）；CD38（+）/CD138（+）/CD19（-）/CD56（+）对MM 患者预后预测价值高于CD19、CD117、CD56、CD138、CD38，差异均有统计学意义（

Z

=4.670、2.019、2.205、2.492、2.553，

P

﹤0.05）；CD38（+）/CD138（+）/CD19（-）/CD117（+）对MM 患者预后预测价值高于CD19、CD117、CD56、CD138、CD38，差异均有统计学意义（

Z

=4.374、2.045、2.511、2.864、2.934，

P

﹤0.05）。ROC 曲线分析结果显示，不同组合对MM 患者预后预测价值均高于免疫表型预后预测价值（

P

﹤0.05），且CD38（+）/CD138（+）/CD19（-）的AUC 最大，提示其预后预测价值最高。（表4、图2）

图2 不同组合预测MM预后的ROC曲线

表4 不同组合对MM 的预后预测价值

3 讨论

MM 是以骨髓中浆细胞异常增殖为特点的恶性肿瘤，疾病早期无特异性表现，发病机制尚不明确，主要为骨髓瘤骨病，导致患者临床表现各异，临床漏诊、误诊率均较高。现阶段国内对MM诊断多采用骨髓穿刺浆细胞比例检测和影像学指标相结合，但骨髓瘤细胞形态与正常细胞类似，导致传统形态学诊断效果欠佳，少数疑似病例无法进行准确诊断。流式细胞技术是近年兴起的一项免疫学技术，该技术能有效弥补传统诊断方式的不足，在不破坏细胞、细胞器、微粒结构及抗原功能情况下，通过流式细胞仪对单细胞进行高速、准确、多参数定量分析。流式细胞技术作为现代骨髓瘤诊断的先进技术，通过其表面特异性抗原表达，能有效鉴别恶性肿瘤细胞，同时也被用于对大多数恶性血液疾病疗效的监测。

MM 作为现阶段无法治愈的疾病之一，主要治疗目的为延长患者生存期，一旦确诊后需长期多次来院检查、复查及治疗，且疾病具有高度异质性，预后差异明显。因此，对患者进行准确的预后判断，再采取对应的治疗方案，是现代骨髓瘤治疗研究的热点方向之一。流式细胞术作为MM检测的高敏技术，能利用肿瘤细胞表面特征性异常表型，将肿瘤细胞与正常细胞进行区分，再通过识别免疫表型的异常表达对MM 进行鉴别诊断。本研究使用流式细胞技术对MM 患者进行鉴别诊断，发现观察组患者CD138 阳性率与对照组比较，差异无统计学意义（

P

﹥0.05），而观察组患者CD19阳性率明显低于对照组，CD117、CD56、CD38 阳性率均明显高于对照组，差异均有统计学意义（

P

﹤0.01），这与林飞燕等研究结果基本一致。本研究发现MM 患者1、2 年生存率分别为83.72%、69.77%，其中CD19、CD117、CD138、CD38免疫表型阳性和阴性MM 患者2 年总生存率比较，差异均无统计学意义（

P

﹥0.05）；CD56 免疫表型阳性MM 患者2 年总生存率高于阴性MM 患者，差异有统计学意义（

P

﹤0.05），这与滑欢和张学军研究结果基本一致，可能是因为CD56 作为免疫球蛋白超家族重要成员之一，对肿瘤细胞归巢起到一定介导作用，导致其在疾病治疗期间呈波动状态。本研究还将其结果进行ROC 曲线分析，发现不同免疫表型对疾病预后预测价值有限，而CD56免疫表型对MM 患者预后有一定预测价值，这可能是因为免疫表型能有效鉴别浆细胞良性和恶性，但单项免疫表型检测会遗漏部分肿瘤细胞群，进而对预测结果造成一定影响。

流式细胞术在恶性浆细胞诊断中的灵敏度远超传统形态学技术，因为传统形态学无法确定其克隆性，容易造成误诊、误治。近年来对MM 免疫表型分析发现，骨髓瘤特异性抗原表达能在一定程度上预测疾病预后，且已阐明多项骨髓瘤特异性抗原表达，明确多种免疫表型临床意义，但尚未统一其设门方案。为此，本研究还将多种免疫表型进行组合，分析不同组合对MM 的预后预测价值，经ROC 曲线分析发现，不同组合对MM 患者预后预测价值均高于免疫表型，说明在临床研究过程中可通过联合诊断提高灵敏度和特异度，进一步提高预后预测价值，同时本研究还发现CD38（+）/CD138（+）/CD19（-）联合诊断的曲线下面积最大，提示其预后预测价值最高。

综上所述，MM 患者与健康人群细胞免疫表型存在明显差异，且使用多参数流式细胞术对MM的诊断有一定价值，可通过不同免疫表型间组合提高其诊断的准确性。随着各种新的单克隆抗体出现，流式细胞术对MM 的诊断会越来越准确和完善。