食管癌与微生态的相关研究进展

吕文晶，左静

1河北医科大学研究生院，石家庄 050011

2河北医科大学第四医院肿瘤内科，石家庄 050011

食管癌发病率居全球恶性肿瘤第七位，病死率居第六位。中国是食管癌高发地区，发病率及病死率均居恶性肿瘤前列。食管癌的组织学类型主要包括食管腺癌和食管鳞状细胞癌（esophageal squamous cell carcinoma，ESCC），中国食管癌以ESCC 更常见，占比超过90%。食管癌的发病因素较多，吸烟、饮酒、饮食粗糙等对食管造成损伤的各类慢性刺激，环境因素，以及遗传因素均是导致食管癌的可疑病因，但导致食管癌的关键因素仍不能明确。因为缺乏灵敏度、特异度高的早期诊断指标及方法，多数患者初次确诊时就已经发生了远处转移，患者的5 年生存率不足20%。因此，临床需要不断探索食管癌发生、发展的机制，以寻找新的食管癌诊断和治疗方法。近年来，对微生物组的研究成为恶性肿瘤领域的研究热点，从口腔至肛门，超过100 万亿个细菌在人体内栖息，并在人体器官中形成了特定菌群（微生物组）。一方面，这些微生物从局部维持稳态到系统地调节机体代谢、造血、炎性反应、免疫反应等方面均发挥着重要作用；另一方面，微生态失调可能导致组织损伤，从而促进产生致癌代谢物的细菌过度增殖，并在各种疾病中发挥重要作用，包括炎性疾病和肿瘤发生发展、转移过程。个体化的微生物群研究是精准医学研究领域的新热点，是对精准医学的补充和延伸。已有研究证实，肠道微生物组在生理状况和疾病状态中均发挥着重要作用，如肥胖、炎症性肠病、糖尿病和高血压等，但临床对食管微生物的研究甚少。本文主要阐述食管癌在微生态领域取得的研究进展，以进一步了解食管癌的发生发展机制，为临床制订有效的诊断和治疗方法提供新思路。

1 正常食管与微生态

对食管微生物群的第一次研究可以追溯至20世纪80 年代早期Gagliardi 等的研究，该研究是基于传统培养方法，证实食管不是一个无菌的环境，食管不仅受邻近器官（口腔及胃部）微生物的影响，也存在原籍定植菌，其中以草绿色链球菌最为常见。但多种细菌的生长较为缓慢，甚至无法培养，因此，简单的培养方法可能会忽略大量细菌，且与其他部位相比，食管取样困难也限制了对食管微生物群的研究。16S 核糖体RNA（ribosomal RNA，rRNA）基因测序的出现，为食管微生物群落的研究提供了根本性的突破，结果表明，食管内含有多种微生物群。2004 年，Pei 等研究发现，食管微生物群主要由“六个门”构成，即厚壁菌门、拟杆菌门、放线菌门、变形杆菌门、梭杆菌门和TM7，与口腔微生物群相当，但重要分类存在差异。链球菌属在食管微生物群中占主导地位（占39%）。2004 年起，越来越多的研究开始探讨食管微生物群，并提出了食管微生物群分类的概念。2009 年，Yang 等将食管微生物分为Ⅰ型和Ⅱ型，Ⅰ型微生物群主要类型为革兰阳性菌（15%），厚壁菌门，主要为链球菌（相对丰度为79%），与正常食管密切相关；而Ⅱ型微生物群主要类型为革兰阴性菌（53%），主要与食管异常有关。2016年Di Pilato等和2018年Deshpande等的研究也得出了相同的结论。由此可见，食管微生态改变可能与食管疾病相关，某些微生物的存在可能促进食管疾病的发生发展。

2 食管腺癌与微生态

近年来，食管腺癌的发病率不断上升，尤其是在西方国家。研究发现，食管腺癌的发病过程为：胃食管反流病（gastroesophageal reflux disease，GERD）—Barrett 食管—低级别上皮内瘤变—高级别上皮内瘤变—食管腺癌。短期反流被认为是生理性的，但反流症状反复时，就会发生GERD，引起与炎症（食管炎）相关的食管黏膜损害。Snider 等研究Barrett 食管向食管腺癌进展过程中微生物结构的改变，结果发现，Barrett 食管和健康对照组间微生物多样性无明显差异，而食管腺癌患者的微生物多样性有所下降。总体来讲，在门水平上，与健康或低级别病变患者相比，高度不典型增生或食管腺癌的变形杆菌门丰度较高，厚壁菌门丰度降低。在属水平上，高度不典型增生或食管腺癌的总肠杆菌和艾克曼菌的丰度增加，而韦荣球菌的丰度降低。Yang 等的研究显示，食管炎或Barrett 食管患者中，微生物多样性会发生变化，链球菌的种类会减少，革兰阴性厌氧菌占比会增大，如韦荣球菌属、普氏菌属、梭杆菌属、奈瑟菌属。Liu等的研究显示，与健康对照组相比，GERD 相关性食管炎和Barrett 食管中的食管微生物群富集了普氏菌属和梭杆菌属。这种从革兰阳性需氧微生物群至革兰阴性厌氧微生物群的转变可能受到微环境变化的影响，并与异常的疾病状态有关。Ⅱ型微生物群可能通过以下三种不同的机制影响食管正常的生理功能：①革兰阴性菌中存在的脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）可 激 活Toll 样 受 体（Toll-like receptor，TLR），并促进促炎性细胞因子如白细胞介素（interleukin，IL）-8 的分泌，这是正常食管向Barrett 食管转化的关键步骤。在Barrett食管和Barrett 食管相关的食管腺癌患者中，核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）通过Barrett 食管的致癌作用进行表达，且NF-κB 在食管腺癌中的表达与新辅助化疗和放疗间存在相关性。总体来讲，在GERD 和Barrett 食管中，微生物群的变化（即革兰阴性菌增多）可能通过诱发慢性炎症触发级联反应导致食管腺癌。②革兰阴性菌可以激活诱导型一氧化氮合成酶（nitric oxide synthase one，NOS1），其激活降低了食管下括约肌的蠕动频率，长期会增加食管癌的发病风险。③革兰阴性菌也可以将食物中的硝酸盐还原为亚硝酸盐，而亚硝酸盐又可以在贲门和远端食管的酸性环境中转化为致癌的N-亚硝基化合物。Lopetuso 等探讨从Barrett 食管进展至食管腺癌的连续光谱中，食管微生物群的潜在特征及其预测的功能特征，为Barrett食管提出了新思路，不仅可以作为食管腺癌的组织学前体，也可以作为食管腺癌最接近的微生物前体。这需要更大样本量的后续研究进一步证实，但为食管腺癌的诊断和治疗提供了新思路，具有潜在的应用价值。

Blackett 等研究发现，某些弯曲杆菌（主要为简明弯曲杆菌）在Ⅱ型微生物群中持续性富集，也被认为与疾病进展为食管腺癌有关，可能因为弯曲杆菌可通过上调食管中IL-18 的表达促进干扰素-γ（interferon-γ，IFN-γ）诱导因子的表达来介导食管腺癌的发生发展。Kaakoush 等的研究指出，简明弯曲杆菌是微生态改变引起食管腺癌发生的使动因素，这为其他菌群在肿瘤微环境中竞争为优势菌群并参与疾病进展提供了有利条件。Gall等研究发现，链球菌与普氏杆菌的比例与Barrett 食管和食管腺癌的一些重要危险因素（如腰臀比、裂孔疝长度）间存在关联，并鼓励开展进一步研究以调查这一发现的临床意义。

3 ESCC 与微生态

与食管腺癌相比，ESCC 中微生物组的特征不明显。Shao 等的研究发现，与非肿瘤组织相比，ESCC 组织含有更多的梭杆菌（3.2%

vs

1.3%）和更少的链球菌（12.0%

vs

30.2%），梭杆菌属的丰度与食管癌分期呈正相关。已有研究显示，上消化道中较低的微生物丰度与食管鳞状发育不良（ESCC 的前体病变）密切相关。

肖晗等将细菌与食管鳞癌细胞Eca109 等共同培养，并检测其炎性因子水平，证实具核梭杆菌通过IL-6 对ESCC 细胞株具有促增殖作用；Transwell 等证实了具核梭杆菌通过CC 趋化因子配体（CC chemokine ligand，CCL）7/CCL21 通路、基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）2/MMP9通路促进肿瘤细胞迁移。Gao 等研究了特定细菌在ESCC 发病机制中的可能作用，该研究着重探讨了ESCC 与牙龈卟啉单胞菌（一种被认为与口腔鳞状细胞癌发生有关的口腔致病菌）间的可能关系，结果显示，牙龈卟啉单胞菌可以选择性地感染ESCC 患者的肿瘤组织和癌旁组织，但不能感染正常食管黏膜。牙龈卟啉单胞菌的促癌机制：牙龈卟啉单胞菌可产生牙龈蛋白酶和MMP，降解细胞外基质蛋白，破坏免疫球蛋白和补体系统（C3、C5），进而通过影响前列腺素E2 途径和Notch 途径，促进肿瘤干细胞及肿瘤新生血管生成，进而分化、进展为ESCC。此外，牙龈卟啉单胞菌的存在与ESCC 的严重程度（即分化程度、淋巴结转移情况、TNM 分期）和预后不良（即ESCC 患者的生存率）呈正相关，因此，有学者提出，牙龈卟啉单胞菌可以作为ESCC的生物标志物。以微生物作为食管癌的生物标志物为切入点，有利于食管癌的早期筛查，期待基于微生物的潜在的分子靶点的研究。

4 食管微生态的影响因素

研究显示，抑酸药如质子泵抑制剂（proton pump inhibitor，PPI）对胃肠道微生物有重要意义，且PPI 治疗前后食管微生物群发生了明显变化，服用PPI 的患者总体上革兰阳性菌增多，革兰阴性菌减少。但PPI 介导上消化道微生物群变化及其二者之间是否存在特定关系、是否参与食管癌的发生、是否为PPI 自身的致癌作用仍然未知，尚需进一步研究加以确认。但Tasnim 等的研究显示，PPI 可能不会引起食管远端微生物菌群的明显变化，应进一步进行更大样本的研究，以确定PPI 与食管微生物菌群的关系。

抗生素的使用可促进食管下段疾病的发生，这可能与抗生素会根除幽门螺杆菌有关。幽门螺杆菌在胃微生物群中占主导地位并可明显增加胃癌的发生风险，但与食管腺癌发病风险呈负相关。研究显示，在观察到食管腺癌发病率升高之前，幽门螺杆菌感染率在20 世纪中叶开始下降。随着抗生素的广泛应用，幽门螺杆菌感染率下降及随后食管腺癌发病率上升间存在的时间关系，表明胃肠道微生物菌群可能在Barrett 食管和食管腺癌的发展中发挥关键的致病作用。日本学者Abe等研究证实，胃溃疡的患者采用抗生素清除幽门螺杆菌后出现了食管下端的恶性腺瘤。Tian 等的研究结果表明，使用抗生素根除幽门螺杆菌感染会影响下段正常的食管微生物菌群。幽门螺杆菌感染降低与食管腺癌风险增加的机制为：抗生素根治幽门螺杆菌后，各种炎性因子如IL-8、IL-1β、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）减少，进而减少胃黏膜损伤，升高胃酸水平，增加胃酸相关性食管损伤风险。微生物菌群作为食管微环境的重要组成部分，可通过多种调控系统和途径维持食管微环境的稳定和平衡；在解剖结构上，食管下端与胃紧密相连，幽门螺杆菌定植于胃内，可能会引起食管下段菌群结构的改变，采用抗生素清除幽门螺杆菌感染也可能引起食管内菌群结构的改变。英国的一项基于人群的队列研究结果表明，青霉素暴露与各种恶性肿瘤（包括食管癌）的发生风险增加存在剂量依赖性关系，但未明确指出食管癌的类型（食管腺癌或ESCC）。由于青霉素没有直接的致癌作用，这种增加的肿瘤风险可能是因为抗生素使用后食管保护性细菌（如链球菌）减少。

5 基于微生态的食管癌影响因素

Nobel 等纳入47 例食管癌患者，进行为期4周的膳食回忆食物频率调查问卷，该问卷确认了脂肪和纤维的摄入量；随后对这些患者进行了食管内窥镜检查，结果发现，增加纤维摄入量与厚壁菌门的相对丰度增加呈正相关，且可整体上降低变形菌和革兰阴性菌的相对丰度。此外，基于脂肪摄入膳食的微生物菌群改变相对较少。

烟草是ESCC 主要危险因素之一。Vogtmann等研究发现，未戒烟者食管内菌群的α 多样性高于不曾吸烟者和已戒烟者，β 多样性低于不曾吸烟者和已戒烟者，而不曾吸烟者和已戒烟者α 多样性和β 多样性无明显差异。烟草致癌的可能机制为：低浓度香烟烟雾提取物（cigarette smoke extract，CSE）通过抑制miRNA-101-3p 的表达，阻断对环氧化酶2（cyclooxygenase 2，COX2）mRNA 表达通路的抑制，从而上调COX2 的表达，促使依赖COX2活性的CSE 诱导肿瘤细胞增殖，从而促进ESCC 的发生。Gong 等进一步指出，miRNA-101-3p 可能是与吸烟相关ESCC 的潜在标志物和治疗靶点。

此外，胃微生物菌群的改变也与食管发育不良和ESCC 有关。伊朗进行的一项病例对照研究显示，胃底某些微生物，如梭菌门的梭状芽孢杆菌的丰度增加，与食管鳞状异型增生和ESCC 有关。口腔微生物菌群的改变也可能与食管癌的发生风险有关，Chen 等的研究显示，唾液中细菌菌群的改变与ESCC 的发生风险增高有关。Peters 等的研究证实，牙周病也增加了ESCC 的发生风险。Poyrazoglu 等研究发现，与健康者相比，ESCC 患者的幽门螺杆菌感染率明显降低（

P

﹤0.01）。ESCC患者在白细胞增多症和血红蛋白不足与幽门螺杆菌感染呈正相关（

P

﹤0.05）。Doorakkers 等的研究发现，Barrett 食管的总发病率升高，但根除幽门螺杆菌后，发病率随时间推移略有下降，根除幽门螺杆菌不影响ESCC 的发病率。Deshpande 等的研究发现，食管菌群的特征与基因、年龄和疾病相关。链球菌和普雷沃菌与ESCC 患者的预后相关。Poore 等与跨学科团队共同开发了一种恶性肿瘤检测的新方法，即通过分析血液中存在的微生物（细菌和病毒）的DNA 模式来明确受试者是否诊断为恶性肿瘤，且能进一步明确恶性肿瘤的类型。期待这种恶性肿瘤诊断方法能开启与肿瘤相关的血液微生物组学研究，填补食管癌血液微生态研究领域的空白，为食管癌的早诊断、早治疗带来新希望。

6 基于微生态食管癌治疗的新进展

近二十年来，随着肿瘤免疫学的深入研究，肿瘤免疫治疗已成为国内外研究的热点之一。研究表明，机体的微生物群也会影响机体对抗肿瘤治疗的反应及对药物不良反应的敏感性。在基于程序性死亡受体1（programmed cell death 1，PDCD1，也称PD-1）/程序性死亡受体配体1（programmed cell death 1 ligand 1，PDCD1LG1，也称PD-L1）抗体的免疫治疗领域，食管癌患者体内的不同的微生物群结构可能影响机体对免疫治疗的响应程度。基于此，Yuan 等以肿瘤免疫微环境为切入点，从基因测序结果出发，发现牙龈卟啉单胞菌定植于食管癌细胞，是近年来食管癌病因研究领域的重大突破，对食管癌的高危人群进行预警筛查和个体化预防具有重要意义。进一步研究发现，牙龈卟啉单胞菌定植于食管癌细胞后可诱导免疫检查点分子B7-H4 及组蛋白去甲基化酶5B（lysine demethylation 5B，KDM5B）高表达，促进肿瘤细胞逃避或破坏宿主免疫应答，进而持久定植。感染和肿瘤的双重因素，加重了宿主免疫的抑制及免疫原性的削弱。该研究进一步探讨了牙龈卟啉单胞菌促进肿瘤细胞免疫逃逸的新机制，为免疫检查点抑制剂进行抗食管癌治疗提供了新靶标，为基于微生态的食管癌的免疫治疗提供了新策略。

7 小结与展望

现有的研究已基本确定了正常食管微生态的细菌组成情况，食管微生态菌群的改变和各种微生物的感染在食管癌的发生发展中发挥了重要作用，但食管微生态成分的改变与食管病变或癌变的因果关系及具体机制尚不能完全明确，也未能找到特定引起食管癌癌变的菌种。进一步了解食管微生物群在疾病发病机制中的作用，以及微生物群改变的方法，可能为食管癌的治疗提供了新的靶点或信号通路，或成为各种食管疾病高危患者的筛查工具。未来的研究或可进一步采用宏基因组学方法、扩大样本数量、绘制同一批患者食管多位点微生物图谱，研究微生物在食管癌中的作用机制及关键通路的改变，旨在为食管癌的早期防治提供新的方向和思路。