肝X 受体β 基因多态性与肺炎脓毒症患者预后的关联研究

刘 瑜，王立群，黄 方，陈阳希，郭 蕾，万文辉，张兴虎

肝 X 受体（liver x receptor，LXR）属于核受体家族成员， 其活化后通过调节靶基因的转录和表达，在维持胆固醇、脂肪酸和葡萄糖等的代谢稳态中具有重要作用［1］。 LXR 有两个亚型，LXRα 主要分布在肝脏等脂肪细胞含量多的组织器官中， 如肝脏，而LXRβ 则全身多系统广泛表达， 并在免疫系统和中枢神经系统具有关键作用。 本研究在华东汉族人群中探讨LXRβ 基因多态性与肺炎脓毒症临床转归的相关性，为临床识别脓毒症高危患者提供参考。

1 对象与方法

1.1 对象 连续收集解放军东部战区总医院2014年2 月 ~ 2015 年2 月收治的肺炎脓毒症患者194例。 纳入标准：肺炎脓毒症诊断明确；年龄 ≥16 周岁；籍贯为江苏及其周边地区的汉族人，相互之间无血缘关系；诊疗资料齐全。 排除标准：入院后24 h内死亡；患有获得性免疫缺陷综合征（AIDS）、自身免疫性疾病、器官移植后、恶性肿瘤等；重要器官功能衰竭； 曾使用过 TNF-α 抗体、INF-γ 等可调节炎症过程的细胞因子；接受激素和（或）免疫抑制剂治疗孕妇。 诊断标准： 脓毒症诊断和分级标准参照2001 年美国胸科医师学会等多学科修订的脓毒症诊疗指南。 本研究纳入脓毒症：肺部感染，合并体温＞38.5 ℃ 或＜36 ℃ 和白细胞总数＞12×109或 ＜4 × 109。 脓毒性休克：脓毒症患者经液体复苏治疗1 h 后动脉收缩压仍 ＜90 mmHg 或需要血管活性药物治疗才能维持收缩压＞90 mmHg。 本研究经本院医学伦理委员会批准 （批准号：2014NZGKJ-024），所有受试者均签署知情同意书。

1.2 方法 本研究采用候选基因的病例对照研究策略，根据不同研究目的，对肺炎脓毒症患者进行分组（死亡/非死亡），研究基因多态性与肺炎脓毒症患者发生死亡、脓毒性休克、器官功能障碍的相关性。 收集患者的一般人口学资料和临床资料，计算诊断脓毒症后 24 h 内 APACHE II 评分， 采用Marshall MODS 评分系统计算患脓毒症期间最高MODS 评分，MODS 评分 ≤ 8 分为轻度器官功能障碍， ＞ 8 分为重度器官功能障碍［2］。 所有入选患者抽取静脉血3 ml，枸橼酸钠抗凝，-80℃保存备用。

1.3 SNP 位点的选择和基因分型 通过检索NCBI Pubmed、dbSNP 数据库和 HapMap 数据库， 找到LXRβ 基因上与疾病相关的SNPs 位点和功能SNPs位点； 最后从HapMap 数据库中选择北京汉族人群样本，以 r2＞ 0.8，得到标签 SNPs（Tag SNPs）。 以在中国人群中次要等位基因频率 （MAF） > 10%为条件筛选得到最终 SNPs 位点 （表 1）。 使用德国QIAGENTM试剂盒提取外周静脉血DNA， 采用连接酶检测反应（iMLDR）方法进行基因分型（上海天昊生物科技有限公司）。

表1 LXRβ 基因单核苷酸多态性位点信息

1.4 统计学处理 采用SPSS 19.0 软件进行统计学分析。 计量资料以（）表示，符合方差齐性采用 t检验，否则采用t' 检验或非参数检验；计数资料组间比较采用 χ2检验或 fisher's test。 采用goodnessof-fit χ2检验，判断每个SNPs 位点是否符合Hardy-Weinberg 平衡。采用非条件logistic 回归模型校正混杂因素后，在不同遗传模式下分析各位点基因型频率与肺炎脓毒症临床转归的相关性，以P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 临床资料 共纳入肺炎脓毒症患者194 例，男性 124 例，女性 70 例，平均年龄（61.90 ± 18.47）岁；平均体质量指数（BMI）为（23.10 ± 4.46）kg/m2，吸烟66 例、饮酒24 例；致病微生物：革兰阴性菌56 例、革兰阳性菌 8 例、真菌12 例、混合性 58 例、无 60例；APACHE II 评分（17.22 ± 7.97）分，MODS 评分（4.69 ± 4.20）分；临床转归：重度器官功能障碍 41例、脓毒性休克 51 例、死亡 57 例（表 2）。

表2 124 例肺炎脓毒症患者存活组和死亡组临床特征比较［例（%），］

表2 124 例肺炎脓毒症患者存活组和死亡组临床特征比较［例（%），］

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2.2 LXRβ 基因多态性与脓毒症临床转归的相关性 所有位点的频率分布在脓毒症组中均符合Hardy-Weinberg 平衡。 与非死亡组相比，死亡组患者年龄偏大、APACHE II 评分更高、MODS 评分更高， 脓毒性休克和器官功能障碍的发生率更高，差异有统计学意义（P ＜ 0.01）（表 2）。 在校正年龄、性别、BMI、吸烟饮酒状态、基础疾病、APACHE II 评分后，非条件 logistic 回归分析显示 rs2695121（C ＞ T）与肺炎脓毒症患者死亡相关，在共显性和隐性遗传模式下 P=0.0074、0.0099（表 3），没有基因多态性与脓毒性休克和器官功能障碍相关。

表3 肝脏X 受体β基因多态性rs2695121 位点与肺炎脓毒症患者死亡的相关性

3 讨论

LXR 具有重要的炎症和免疫调控作用，LXR 通过反式抑制核因子 κB（NF-κB）、激活蛋白 1（AP-1）等的转录活性而抑制致炎因子如肿瘤坏死因子-α（TNF-α）等的产生［3-5］。 LXR 还能通过促进脂质代谢相关基因如ATP 结合盒转运蛋白A1（ABCA1）的表达、促进长链不饱和脂肪酸合成、诱导巨噬细胞向 M2 型等发挥抗炎作用［6-8］。 此外，LXR 还可在转录后水平发挥抗炎作用，如促使TNF-α、白介素-1β（IL-1β）及 IL-6 等 mRNA 降解［9］。

脂质代谢产物对炎症和免疫反应具有重要调控作用。胆固醇及其衍生物，是LXR 的天然激动剂。LXR 活化后一方面可调控脂质代谢相关基因的表达，另一方面，这些脂质代谢相关物质还具有抗炎作用［1］。 ABCA1 通过去除过多的游离胆固醇而减轻对细胞的毒性作用，抑制Toll 样受体（TLRs）激活，下调NF-κB、丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）等信号通路而抑制炎症因子的表达。 溶血卵磷脂酰基转移酶3（Lpcat3）是LXRs 的靶基因，该酶能够通过作用于脂肪酸使膜脂组成及相关炎症信号转导发生改变，也可减轻炎症反应［10］。 体外研究证实，预先给予LXR 激动剂能减轻脂多糖诱导的炎症反应；LXR 基因敲除大鼠对脂多糖和其他病原微生物刺激表现出更强的炎症反应［11］。 因此，LXR 是将脂质代谢与免疫和炎症反应联系起来的桥梁，LXR 也成为治疗炎症相关疾病包括脓毒症的新靶点。 目前，在中国汉族人群中，还未见关于LXR 基因多态性与脓毒症相关性的报道。

本研究选择了LXRβ 基因上常见的6 个SNPs位点，经校正其他临床因素后，发现rs2695121 与肺炎脓毒症患者死亡相关（在共显性和隐性遗传模式下），入选的肺炎脓毒症患者均为华东汉族人群，最大程度的避免了人群分层对结果的影响。 既往LXRβ 基因多态性与疾病相关性研究大多集中在代谢性疾病，如 2 型糖尿病（T2DM）、肥胖等。 唯一与炎症性疾病有关的是Andersen 等［12］在丹麦人群中发现rs2695121（T）能够增加溃疡性结肠炎发病风险，提示rs2695121（T）与炎性反应不良预后有关。本研究结果显示， rs2695121（C→T）在共显性和隐性模型中与死亡风险增高相关， 提示rs2695121（C→T）是脓毒症预后不良的危险因素。 由于该位点在内含子2 中，研究表明，位于非编码区的SNP 仍然具有功能，如位于内含子中的SNP 虽然生物学效应的可能性较小，但仍可影响mRNA 的剪切、稳定性或定位来影响基因的功能，或是通过与基因中具有生物活性的SNP 连锁而表现出功能，其影响脓毒症预后的机制还有待进一步研究［13］。

本研究发现LXRβ 遗传多态性与肺炎脓毒症患者死亡相关。 由于肺炎脓毒症患者均来自于医院，研究本身存在选择偏倚。 同时，本研究样本量较少，统计效力不够，导致一些低外显率的SNPs 位点的效应发现不了， 所选择的位点并不能代表LXRβ基因中所有的遗传变异信息，不排除该基因中还有其他位点与脓毒症相关。 对于得到的结果下一步我们还要扩大样本量进行验证。