第二代测序技术用于全膝关节置换术后假体周围感染诊断的临床价值

董伊隆 钱约男 李一民 刘良乐 蔡春元

假体周围感染（periprosthetic jiont infection，PJI）是人工关节置换术后的严重并发症。PJI的正确诊断和病原体的确定是关节翻修手术的关键。而在临床上，往往关节液常规细菌培养阴性。一些研究表明细菌培养阴性PJI的发病率达50%[1-2]。临床医生不知道感染的病原体，就无法有效地监测患者对治疗的反应，并确定感染是否得到控制。因此，许多学者正致力于探索并评估一些新的PJI诊断指标，以解决这一难题。

第二代测序技术（next-generation sequencing，NGS）是一种新的DNA/RNA测序方法[3]。NGS由于其成本低和检测快速被应用于医学微生物学，可以有效提高识别病原体的效率[3-4]。然而，NGS用于PJI患者的检测鲜有报道，因此笔者对NGS用于PJI患者关节液中病原体的检测进行了研究，并与常规细菌培养结果进行比较分析，现将结果报道如下。

1 对象和方法

1.1 对象 选择2017年1月1日至2019年12月1日温州医科大学附属第三医院就诊的全膝关节置换术（total knee arthroplasty，TKA）后临床怀疑为PJI的15例患者，其中男6例，女9例；年龄57～81岁，平均66.5岁；置换术前均诊断为膝关节骨性关节炎。15例患者均行膝关节穿刺关节液细菌培养和NGS检测。本研究经本院医学伦理委员会批准，所有患者均签署知情同意书。

1.2 纳入与排除标准 纳入标准：（1）初次TKA后；（2）TKA后出现体温升高、膝关节皮温升高，膝关节出现肿胀、积液、静息痛、窦道或假体松动等症状和体征[5]，临床怀疑PJI；（3）送检关节液标本符合NGS检测细菌培养的要求。排除标准：（1）肿瘤、自身免疫性疾病等非感染性疾病患者；（2）送检标本量不能满足NGS检测要求，或已被细菌污染；（3）拒绝签署知情同意书者。

1.3 关节液采集 选择皮肤完整处进行穿刺，常规消毒铺巾。髌骨外上方穿刺，可由股四头肌腱外侧向内下刺入关节囊；髌韧带旁穿刺，可由髌骨下方膝眼处向后刺入关节囊；若上述穿刺失败，可在超声引导下进行穿刺抽液。抽取2份关节液，每份2 ml，1份进行常规细菌培养，1份进行NGS检测。

1.4 细菌培养 关节液行常规需氧和厌氧菌培养；培养基分别为血平板、巧克力平板及BacT/Alert FN血培养瓶；培养板放置于恒温37.0℃培养箱，血培养瓶置于梅里埃血培养箱。所有标本培养1周。

1.5 NGS测序

1.5.1 样品保存 按照标准程序所采集的关节液即刻冷冻，保存温度为-20℃。

1.5.2 DNA提取、文库构建及测序 采用TIANamp微DNA试剂（DP316，天根生化科技有限公司）直接从关节液中提取DNA。通过DNA片段化、末端修复、连接和PCR扩增构建DNA文库。Agilent 2100用于DNA文库的质量控制。通过BGISEQ-50平台对质量合格的DNA文库进行排序[6]。

1.5.3 数据处理与分析 通过去除低质量、低复杂度、短于35 bp的读数得到高质量测序数据。利用BurraveWeler-Read数据处理和分析消除人类序列的影响[7]。然后将剩余的数据对准微生物基因组数据库，微生物基因组数据库包括细菌、病毒和真菌等目前可以知晓的所有微生物。删除重复读取获得映射数据，保留并最后分析高级数据。其中微生物基因组数据是从美国国家生物技术信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）下载（FTP://FTP.NCBI.NLM.NIH.gov）[8]。本研究所用数据库包含2 473个细菌属、4 061个与人类疾病相关的病毒种类、199个与人类感染相关的真菌种类和135个与人类疾病相关的寄生虫，其资料来自SOAP网站（http://SOAP.GnEngor.org.cn）[9]。对细菌含量占总序列＞1%的细菌属进行统计。

1.6 统计学处理 采用SPSS 15.0统计软件。计数资料以例数（率）表示，组间比较采用Fisher确切概率法。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 15例患者关节液细菌培养和NGS检测结果

2.1.1 细菌培养 15例TKA术后关节感染患者微生物培养阳性10例（其中例4同一标本培养出2种细菌），分别培养出表皮葡萄球菌4例，金黄色葡萄球菌2例，停乳链球菌1例，黏液奈瑟菌1例，无乳链球菌1例，脆弱拟杆菌1例，大肠埃希菌1例；培养阴性5例，见表1。

2.1.2 NGS检测 15例患者关节液中均发现细菌，其中例1至例10 NGS检测细菌菌属与细菌培养结果一致。除了例4外，其余9例NGS检出的优势菌群与细菌培养结果一致。例7、8、9 NGS检测仅检出1种细菌属，且均与细菌培养结果一致。细菌培养阴性的5例中，例11检出1种细菌，为大芬戈尔德菌（85.69%），例12仅检出链球菌属（76.98%），例13检出2种细菌，为葡萄球菌属（90.38%）和奈瑟菌属（10.62%），例14仅检出厌氧菌属（89.27%），例15仅检出念珠状链杆菌（79.85%），见表1。

表1 15例患者关节液细菌培养和N G S检测结果

2.2 关节液细菌培养与NGS检测结果的比较 在细菌培养阳性的10例标本中检出细菌属种类10种，NGS检出细菌属种类15种，两者比较差异有统计学意义（P=0.042）；其中9例标本NGS检测出的优势菌群（丰度最高）与细菌培养一致。在细菌培养阴性的5例标本，NGS均检出细菌，其中例11、14和15为苛养菌。

3 讨论

PJI是人工关节置换术后的严重并发症，给患者带来了巨大的经济、心理负担，增加患者术后病死率。PJI的发病率在全髋关节置换术后约为1%，而TKA后约为1%～2%[10]。流行病学调查研究显示，PJI已经成为髋关节翻修术的主要原因之一[11]，也是膝关节置换术后翻修的首要原因[12]。治疗过程艰巨，治疗结果往往较差。为了最大限度地发挥治疗效果，必须准确识别病原体，正确的病原体鉴定对于获得抗生素敏感性和减少抗生素的应用范围是必要的[13]。传统的关节液穿刺抽取培养已经成熟，但仍存在一些缺陷。有文献报道PJI假体周围组织培养阳性率仅55.73%[14]。本研究结果发现，关节液培养阳性率为66.67%（10/15），与上述文献报道的培养阳性率接近，细菌培养阳性率不高。同时细菌培养所需的时间非常久，一般需要培养5 d，甚至更长时间才能得到细菌菌落[15]，影响抗生素的早期使用。但传统的培养方法无法检测到已经形成生物膜的微生物，或者已经在成骨细胞中被内化的微生物。标本中病原体的数量也会影响培养结果的准确性。此外，许多存在感染表现的患者常在获得液体样品之前进行了经验性抗感染治疗，而关节液穿刺抽取前的抗生素治疗可能产生假阴性培养物[16]。本研究培养阴性的5例标本中，例12和例13检查前使用抗生素。另外某些苛养菌不易培养。鉴于这些缺点，人们不得不探索更灵敏的检测方法来检测关节液中的PJI证据。

NGS检测是一种简单、复杂的快速、准确的分子诊断方法。在每个操作中产生数百万至十亿个DNA/RNA序列的能力使得宏基因组分析比传统的Sanger测序具有显著的优势。它是一个无偏的分析，因为它可以放大和测序样品的整DNA含量，而不使用任何引物或探针。理论上，无偏NGS有助于在一次测定中识别所有潜在的病原体。目前已释放出43 000余株微生物基因组，包括38 000种细菌和5 000种病毒[17]，这些数据还含有人类病原体的重要代表，它们的可用性将对微生物病原体NGS检测和应用产生重大影响[17-18]，有助于识别常见、罕见甚至新病原体。理论上，几乎所有病原体都可以根据长读数的长度、微生物基因组的生命数、核酸的特定序列以及参考数据库的完整性来确定。黄子达等[19]利用NGS检测在假体周围感染中的病原菌，结果发现关节液NGS诊断敏感度明显高于关节液培养及组织培养。在本研究中，所有标本NGS检测均发现细菌，阳性率为100%，远高于细菌培养的66.67%，结果同黄子达等[19]一致。在例4中，细菌培养中发现2种细菌，而NGS发现8种细菌；在例6中，细菌培养发现1种细菌，而NGS发现5种细菌。这2例患者为慢性感染患者，在取材之前经多种抗生素的不规范治疗，说明抗生素滥用导致多重细菌混合感染可能。例7、8、9、10系早期感染，例7术前存在牙周炎，例8术前存在尿路感染，说明关节置换术前要排除全身是否存在感染灶。例1、7的皮肤均有破溃流脓，考虑细菌毒力强，细菌培养提示金黄色葡萄球菌生长，同时在例1中，NGS检出3种细菌，考虑外界环境中的细菌可能通过破溃口污染关节液。在细菌培养阴性的5例标本中，发现例12、13术前使用抗生素，术前抗生素的使用影响培养的结果，而NGS可以直接读取抗生素灭活细菌的残留DNA。例11、14和15 NGS结果提示为苛养菌，可根据NGS结果选择合适培养基后进行再次细菌培养和药敏试验。

同时，NGS存在许多不足之处：（1）仅能提示某种细菌感染，而无法给出对于临床治疗所需要的细菌药物敏感。故目前临床上可根据NGS的结果提示，选择NGS所提示的细菌选择合适的培养基再次培养，并进行药敏试验；（2）NGS的灵敏度过高，对于已经被灭活的细菌残留DNA，亦能进行读取，故降低了诊断的特异性；（3）NGS需要进行标本的DNA提取、文库构建及测序，过程较为繁琐，并且一个流程的失败，将导致整个读取的失败；（4）相对于传统的细菌培养，NGS的费用较多，不适用于普及开展。

综上所述，NGS是一种快速、准确的的诊断方法，为常规细菌培养方法的补充，能检出细菌培养以外的细菌，特别对于细菌培养阴性的标本更具诊断意义。